目的心力衰竭(heart failure,HF)是多种心脏疾病发展到终末阶段的临床症候群,主要表现为心肌收缩功能的降低,严重威胁人类的身体健康。中国作为世界上拥有最大心衰患者群的国家之一,研究心衰的发病机制并改善衰竭心脏的心功能,提高心衰患者的生存质量是目前亟待解决的问题。心衰的机制在细胞水平上主要涉及心肌细胞损伤,心肌细胞属于终末期细胞,其损伤对于心脏的形态结构具有不可逆性改变。因此,本课题旨在通过阿霉素复制心肌细胞损伤模型,在细胞水平上探讨Liguzinediol对阿霉素诱导的心肌细胞损伤的保护作用及机理。方法1.Liguzinediol对阿霉素诱导的H9C2细胞损伤的影响利用MTT检测不同浓度Liguzinediol作用于H9C2细胞24和48小时,确定Liguzinediol对正常心肌细胞是否有毒性;然后将不同浓度阿霉素作用于H9C2细胞24小时,确定阿霉素损伤心肌细胞50%的浓度;在此基础上筛选Liguzinediol对阿霉素诱导的H9C2细胞损伤有保护作用的高、中、低三个浓度。然后将H9C2细胞分为:空白对照组、阿霉素组、Liguzinediol高、中、低剂量组,观察Liguzinediol对阿霉素诱导的H9C2细胞损伤的保护作用;胶原收缩实验观察Liguzinediol对阿霉素诱导的受损的H9C2细胞收缩功能的影响。2.Liguzinediol对阿霉素诱导的H9C2细胞凋亡的影响利用Hochest33258染色以及流式细胞术FITC/PI染色观察Liguzinediol对阿霉素诱导的H9C2细胞凋亡的影响;Western blot观察Liguzinediol对阿霉素诱导的心肌细胞凋亡相关蛋白Pro-caspase-3、Cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2以及细胞色素C(CytC)表达的影响。3.围绕钙稳态探讨Liguzinediol抑制阿霉素诱导H9C2细胞凋亡的机理首先利用钙成像技术观察Liguzinediol在有钙缓冲液和无钙缓冲液中对大鼠原代心肌细胞内钙离子浓度的影响;再通过灌流阿霉素动态观察其对心肌细胞内钙离子浓度的影响,进而观察Liguzinediol对阿霉素诱导的心肌细胞内钙稳态失衡的调控;Western blot和PCR分别观察Liguzinediol对阿霉素诱导的心肌细胞肌浆网和线粒体内钙相关转运体及其信号通路的影响。结果1 Liguzinediol能够减少阿霉素诱导的H9C2细胞损伤MTT结果表明,与空白对照组比较,Liguzinediol的浓度低于10-1mol/L浓度时对H9C2细胞无毒性,说明Liguzinediol的浓度在低于10-1mol/L属于安全范围,可用于后续实验。阿霉素复制H9C2细胞损伤模型的结果表明,阿霉素浓度为5μmol/L时,其损伤率达50%左右,因此选择此浓度作为后续试验的造模浓度。与空白对照组比较,阿霉素组H9C2细胞的吸光度(OD值)明显降低,具有显著性差异;在此基础上给予不同浓度的Liguzinediol,结果与阿霉素组比较,Liguzinediol(10-4、10-5、1 0-6mol/L)能够明显增加H9C2细胞活力并呈剂量依赖性,说明Liguzinediol能够减轻阿霉素诱导的H9C2细胞损伤。胶原收缩实验结果表明,与空白对照组比较,阿霉素组H9C2细胞收缩功能明显降低,胶原面积增加,收缩减少;与阿霉素组比较,Liguzinediol能够明显改善阿霉素诱导的H9C2细胞收缩功能的降低引起胶原收缩面积减少,收缩增加,说明Liguzinediol能够增强阿霉素诱导的受损H9C2细胞的收缩功能。2 Liguzinediol可明显抑制阿霉素诱导的H9C2细胞凋亡Hochest33258染色结果显示阿霉素组出现H9C2细胞染色质固缩、细胞质亮染以及细胞核碎裂等凋亡的典型特征,给予Liguzinediol后能够明显减少凋亡的发生;流式细胞术结果发现,与空白对照组比较,阿霉素组H9C2细胞的凋亡率显著增加,给予Liguzinediol后凋亡率明显降低;Western blot检测结果表明,与空白对照组比较,阿霉素组凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3以及细胞色素C(CytC)的表达增加而pro-Caspase-3蛋白表达减少,给予Liguzinediol后,与阿霉素组比较pro-Caspase-3蛋白表达增加而Cleaved-caspase-3以及CytC的蛋白表达减少。另外,与空白对照组比较,阿霉素组Bax的蛋白表达显著增加而Bcl-2的蛋白表达减少,使Bax/Bcl-2的比例增加,给予Liguzinediol后,与阿霉素组比较Bcl-2表达明显增加引起Bax/Bcl-2的比例相对减少,说明Liguzinediol能够通过抑制Cleave-Caspase-3、Bax和CytC的蛋白表达而改善阿霉素诱导的心肌细胞凋亡。3 Liguzinediol通过调控细胞内钙稳态抑制阿霉素诱导的心肌细胞凋亡3.1 Liguzinediol对阿霉素诱导的受损的原代心肌细胞的外钙内流和内钙外排无影响钙离子荧光检测结果表明,与空白对照组比较,阿霉素组原代心肌细胞内钙离子浓度显著增加;与阿霉素组比较,给予Liguzinediol后原代心肌细胞内钙离子浓度明显降低。钙成像结果表明,在有钙缓冲液与无钙缓冲液灌流的条件下,加入Liguzinediol均能够引起细胞内钙离子增加,说明Liguzinediol对细胞内钙离子的调控与外钙内流无关;阿霉素灌流后与灌流前比较,阿霉素能够明显增加细胞内的钙离子荧光强度;给予Liguzinediol后,与阿霉素组比较其钙离子变化明显降低,说明Liguzinediol能够降低阿霉素诱导的原代心肌细胞钙离子增加。Western blot检测心肌细胞膜上钠钙交换体(NCX)的表达,实验结果表明,与空白对照组比较,阿霉素能明显增加细胞膜上NCX的表达,Liguzinediol处理后,与阿霉素组比较,NCX的表达无明显改变,说明Liguzinediol不通过心肌细胞膜上的钠钙交换体来实现其对细胞内钙离子的调控,从而抑制心肌细胞的凋亡。3.2 Liguzinediol通过肌浆网内钙相关转运体调控阿霉素诱导受损H9C2细胞内钙稳态失衡Western blot结果表明,与空白对照组比较,阿霉素组肌浆网钙泵(SERCA2a)、兰尼碱受体(RyR2)、肌浆网RyR2稳定蛋白FKBP12.6以及三磷酸肌醇受体(IP3R2)的表达显著降低,而p-RyR2的蛋白表达水平增加;给予Liguzinediol后,与阿霉素组比较SERCA2oα、RyR2、FKBP12.6以及IP3R2的蛋白表达水平增加,而p-RyR2的水平降低,说明肌浆网内SERCA2α等钙相关转运体参与Liguzinediol对细胞内钙稳态的调控。3.3.Liguzinediol通过线粒体内钙相关转运体调控阿霉素诱导受损H9C2细胞内钙稳态失衡Western blot结果发现,与空白对照组比较,阿霉素组线粒体钙单向转运体(MCU)、电压依赖性阴离子通道(VDAC)以及线粒体自噬相关蛋白Fundcl表达增加;给予Liguzinediol后,与阿霉素组比较,其线粒体相关蛋白MCU、VDAC以及Fundcl表达明显下降,说明线粒体内MCU等钙相关转运体参与Liguzinediol对心肌细胞内钙离子的调控。另外,Western blot实验结果发现,与空白对照组比较,阿霉素组线粒体融合相关蛋白MFN1和MFN2蛋白表达减少,给予Liguzinediol后,与阿霉素组比较,MFN1和MFN2蛋白表达增加;与空白对照组比较,阿霉素组线粒体分裂相关蛋白(Fis1)和线粒体动力相关蛋白(Drp1)的表达增加,给予Liguzinediol后,与阿霉素组比较,Fis1和Drp1的表达降低,说明Liguzinediol对细胞内钙稳态的调控与线粒体的分裂和融合有关。3.4 Liguzinediol通过CaMKII以及PLC-IP3R2信号通路调节阿霉素诱的受损心肌细胞内钙稳态失衡在心肌细胞内调控细胞内钙离子的相关通路有cAMP-PKA、CaM/CaMKII以及PLC-IP3R2。ELISA结果表明,与空白对照组比较,阿霉素组H9C2细胞cAMP的释放显著增加,给予Liguzinediol后,与阿霉素组比较,cAMP的含量没有明显影响。Western blot结果发现,与空白对照组比较,阿霉素组蛋白激酶A(PKA)、钙调神经磷酸酶(CaN)以及磷脂酶C(PLC)的表达明显增加,给予Liguzinediol后,与阿霉素组比较Liguzinediol能够明显降低PLC蛋白的表达水平,而对PKA没有明显影响。说明Liguzinediol对心肌细胞内钙离子的调控主要与Ca2+/CaMKII以及PLC-IP3R2信号通路有关。结论1 Liguzinediol减少阿霉素诱导的H9C2细胞损伤,通过抑制H9C2细胞凋亡相关蛋白的表达发挥其抗凋亡的作用。2 Liguzinediol作用于肌浆网和线粒体上钙相关转运体调节阿霉素诱导的H9C2细胞内钙稳态失衡,从而抑制H9C2细胞凋亡。3 Liguzinediol通过Ca2+/CaMKII以及PLC-IP3R2信号通路调节心肌细胞内的钙稳态,抑制阿霉素诱导的心肌细胞凋亡和增加心肌细胞的收缩力。