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研究背景:我国是乙肝的重灾区,大约有1.2亿人为乙肝表面抗原(Hepatitis B surface Antigen,HBsAg)携带者,多达2000万的慢性乙型肝炎患者,其中有相当一部分会进展为肝硬化和肝癌。当前国内外慢性乙型肝炎防治指南均提出了抗病毒治疗的重要性,应对免疫清除期(IC)或HBeAg阴性的慢性乙型肝炎(ENH)患者应进行规范的抗病毒治疗。通过抗病毒治疗,抑制病毒复制,减轻肝细胞炎症坏死及纤维化,延缓和减少肝硬化、肝癌及并发症的发生。但是目前已有的干扰素、核甘(酸)类似物仍然难以达到HBsAg转阴的理想治疗终点,虽然有研究表明干扰素联合核甘(酸)类似物或者免疫调节剂可以提高疗效,但是目前乙肝治愈仍然是一个难题,亟需建立新的抗病毒/免疫调节联合治疗新方法提高慢乙肝的功能性治愈率。目前已有的抗乙型肝炎病毒药物并不能彻底的清除肝细胞中的造成HBV持续感染的主要元凶共价闭合环状DNA,即cccDNA。虽然新的联合治疗抗病毒免疫调节治疗方案可以提高乙肝抗病毒治疗HBeAg的血清学转化率和s抗原的血清学转换率,但是仍然难以达到让人非常满意的效果,寻找治疗前和治疗中的疗效预测指标,以期针对患者的具体情况给予个体化治疗方案,是抗病毒领域的难点及热点问题,也是提高疗效和节约医疗资源很好的方式。代谢组学是从整体层面上检测疾病状态下代谢物的的种类、数量及其变化规律的科学,因而代谢组学技术在肝脏疾病的早期诊断、发病机制及疗效预测等方面研究中起到了不可忽视的作用。本研究建立基于超高效液相色谱质谱联用(UPLC/MS)和气相色谱质谱联用的(GC/MS)的血清代谢学方法,寻找血清中可以预测抗病毒治疗疗效的血清生物标志物,以指导慢性乙型病毒性肝炎功能性治愈的抗病毒治疗方案选择。第一部分:提高慢乙肝功能性治愈率抗病毒/免疫调节治疗新方法的研究方法:HBeAg阳性慢性乙型病毒性肝炎初始治疗患者按随机、前瞻性原则分为2组接受新的抗病毒/免疫调节治疗,分别为:(1)干扰素a(IFN-a)+ADV(阿德福韦酯);(2)IFN-a+ADV+GM-CSF(粒细胞巨噬细胞击落刺激因子);IFN-a+ADV治疗组入组59例,IFN-a+ADV+GM-CSF治疗组入组69例,治疗48周,其中IFN-a+ADV治疗组退出或者失访7例,IFN-a+ADV+GM-CSF治疗组3例。新的抗病毒/免疫调节治疗方案:分别在第0、4、12、24、36、48周的每周三、周四、周五连续三天接受GM-CSF治疗,治疗方法:75ug,皮下注射一天一次。药物使用方案:IFN-α皮下注射qod(隔天一次);ADV 1Omgqd(空腹口服一天一次)。随访的时间点分别在治疗的0、4、8、12、24、36、48周。分析在治疗后的24周和48周时肝功能的恢复情况以及HBV转阴率(HBV DNA<20IU/ml),HBeAg血清学转换率,s 抗原转阴率(HBsAg<0.05IU/ml)。结果:两组患者的一般资料在基线时比较无统计学差异,治疗第24周,IFN+ADV+GM-CSF 组 ALT 复常率为 75.76%,高于 IFN+ADV 组的 57.69%(p<0.05);IFN+ADV+GM-CSF 组 HBVDAN 转阴率(HBV DNA<20IU/ml)为 77.27%,略高于 IFN+ADV 组的 69.23%,但是没有统计学意义(p=0.324);IFN+ADV+GM-CSF组HBeAg血清学转换率(e抗原转阴,e抗体出现)为33.33%,显著高于IFN+ADV组的19.23%(p=0.041);IFN+ADV+GM-CSF组s抗原转阴率(s抗原转阴或者s抗原血清学转换率)为1.51%,高于IFN+ADV组的0%(p=0.373);治疗第48周,IFN+ADV+GM-CSF组的ALT复常率为91.93%,高于IFN+ADV组的 82.69%(p=0.134);IFN+ADV+GM-CSF 组的 HBVDAN 转阴率为 89.39%,略高于 IFN+AD 组的 84.61%,(p=0.439);IFN+ADV+GM-CSF 组的 HBeAg 血清学转换率为 53.03%,高于 IFN+ADV 组的 30.77%(p=0.015);IFN+ADV+GM-CSF组的 s抗原转阴率为 6.06%,高于IFN+ADV组的 1.92%(p=0.268);IFN+ADV+GM-CSF组s抗原滴度较基线下降大于90%以上的比例为54.55%,高于 IFN+ADV 组的 34.62%(p=0.031)IFN+ADV+GM-CSF 组的 s 抗原滴度较基线下降小于50%的比例为13.64%,低于IFN+ADV组的38.46%(p=0.002)。第二部分:基于UPLC/MS和GC/MS血清代谢组学方法在慢乙肝抗病毒疗效预测中的应用方法:选取提高慢乙肝功能性治愈率抗病毒/免疫调节治疗新方法研究入组的患者作为本部分的研究对象。根据疗效不同分为HBeAg血清学转换组和非HBeAg血清学转换组。其中T1治疗组(IFN+ADV),HBeAg血清学转换患者16例,非HBeAg血清学转换患者36例;T2治疗组(IFN+ADV+GM-CSF),HBeAg血清学转换患者35例,非HBeAg血清学转换患者31例。采集第0周,24周和48周患者血清标本放到EP管-80℃保存。所有血清样品在处理的前一天晚上从-80℃放到4℃解冻。同一份样品分为2份,1份进行液相色谱质谱检测,另一份进行液相色谱质谱检测,所有样品随机进行检测。UPLC/MS数据经去噪音、峰提取、去卷积、归一化处理后导入Simca-P 13.0处理,进行PCA,OPLS-DA分析。筛选标志物基于P<0.05,Fold change>1.5规则。数据库检索基于本地HMDB数据库。GC/MS质谱数据经XCMS处理导出包含样本定量定性信息的矩阵。NIST17数据库比对解析完成后,再经归一化处理,应用SIMCA13.0进行进一步进行OPLS-DA分析。SPSS软件(16.0),克鲁斯卡尔-沃利斯检验进行多因子非参数差异分析,选取差异代谢物(p<0.05)。有显著性差异的代谢物和HBsAg,HBsAb,HBeAg,HBeAb,HBcAb和HBVDNA应用spearman相关性分析。结果:建立了基于UPLC/MS和GC/MS可以预测HBeAg血清学转换的血清代谢组学诊断模型。应用UPLC/MS的技术对接受抗病毒治疗的慢性乙肝患者第0周、24周和48周血清进行代谢组学分析。对不同治疗组按疗效(是否发生HBeAg血清学转换)在第0周,24周和48周的代谢物进行PCA发现不同治疗组发生HBeAg血清学转换的患者和未发生HBeAg血清学转换的患者的代谢指纹有明显差异。进一步应用OPLS-DA对样本进行分析发现,对不同治疗组按疗效(是否发生HBeAg血清学转换)在第0周,24周和48周能够更好的区分。对分组贡献大的(p<0.05,FD>1.5)的代谢物进行鉴定,发现发生HBeAg转换的患者在第0周时十二碳烯酸浓度低,在治疗的第24和48周三酰甘油TG(16:1/16:1/16:1)和SM(d18:1/24:0)浓度高。对不同治疗组发生HBeAg血清学或未发生HBeAg血清学转换的患者在第0周,24周和48周的血清代谢物进行OPLS-DA进行分析,发现不管接受T1治疗还是T2治疗,发生HBeAg血清学转换的患者在第0周、24和48周的的血清代谢物能够很好区分。未发生发生HBeAg血清学转换的患者在第0周、24和48周的的血清代谢物也能够很好区分。对分组贡献大的(p<0.05)的代谢物进行鉴定,发现发生HBeAg血清学转化的患者血清中磷脂酰胆碱(PC(18:1/18:1)、PC(20:1/14:1)、DG(14:1/22:4/16:0)、SM(18:0/14:0)、SM(17:1/24:1)浓度进行性降低;2-Arachidonylglycerol、8-Hydroxydesmethylclomipramine、3,4-Methylenesebacic acid、N-Acetylglutamine、TG(16:1/16:1/16:1)、SM(18:1/24:0)、SM(17:1/24:0)、2-Arachidonylglycerol、8-Hydroxydesmethylclomipramine 浓度进行性升高。应用GC/MS的技术对接受抗病毒治疗的慢乙肝患者第0周、24周和48周血清进行代谢组学分析。代谢组原始数据解析,比对数据库NIST17,共鉴定出结果较为可靠的代谢物70个。对不同治疗组发生HBeAg血清学或未发生HBeAg血清学转换的患者在第0周,24周和48周的血清代谢物进行OPLS-DA进行分析,发现不管接受T1治疗还是T2治疗,发生HBeAg血清学转换的患者在第0周、24和48周的的血清代谢物能够很好区分。未发生发生HBeAg血清学转换的患者在第0周、24和48周的的血清代谢物也能够很好区分。说明基于GC/MS的OPLS-DA模型可以用于HBeAg血清学转换的疗效预测。克鲁斯卡尔-沃利斯检验进行多因子非参数差异分析,选取差异代谢物(p<0.05),有显著性差异的代谢物和HBsAg,HBsAb,HBeAg,HBeAb,HBcAb 和 HBVDNA 应用 spearman 相关性分析。发现发生HBeAg血清学转换的患者血清中富马酸((E)-2-Butenedioic acid),乙醇胺(Ethanolamine)浓度进行性下降,D-塔罗糖(D-Talose)和D-阿洛糖(D-Allose)进行性升高。富马酸((E)-2-Butenedioic acid)、3-a-甘露聚糖(3-alpha-Mannobiose)和甘氨酸(Glycine)与HBeAg的浓度呈正相关,D-阿洛糖(D-Allose)和HBeAg的浓度呈负相关,富马酸((E)-2-Butenedioic acid)、3-a-甘露聚糖(3-alpha-Mannobiose)和甘氨酸(Glycine)与HBsAg的浓度呈正相关。结论:IFN-a+ADV+GM-CSF抗病毒/免疫调节抗病毒治疗方案可以提高HBeAg血清学转换和s抗原的转阴率。通过对接受新的抗病毒/免疫调节治疗方案的慢性乙肝患者血清进行代谢组学的研究,结合PCA和OPLS-DA多变量统计方法,发现基于代谢组学寻找的血清标志物对抗病毒疗效有很好的预测作用,可以用于治疗前或治疗过程中疗效的预测及监测,从而进一步提高抗病毒的疗效、节约医疗成本。