金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作为一种人类常见的、非常重要的病原菌，其隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus)，有“嗜肉菌”的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染，在人类化脓感染中的病原菌中最为常见，除了能引起局部的化脓性感染，也可以引起肺炎、肠炎以及心包炎等，甚至有可能导致败血症和脓毒症等全身感染。　　金黄色葡萄球菌可以产生多种肠毒素，有A、B、C、D、E、F等。金葡菌食物中毒以A型肠毒素引起者最多。肠毒素对热的抵抗力极强，加热至100℃、30分钟不能完全破坏，仍能使人致病，其中以B型最耐热。金黄色葡萄球菌肠毒素属于超抗原家族的细菌蛋白，能够激活大量的T细胞亚群，引起炎性细胞因子的大量释放，这个反应能被级联放大，从而引起高热、恶心、腹泻，最终可以导致中毒性休克综合征（TSS），从而引起死亡。由金黄色葡萄球菌B型肠毒素（SEB）引起的TSS病死率可以高达50％。SEB由于其稳定性强，制备简单，成本低廉，能够大量生产，引起疾病严重，所以被美国列为常规储备的标准生物战剂，也为经典的生物战剂。　　目前，在临床治疗中，对 SEB中毒的治疗均为对症治疗，未有特效的治疗药物。David课题组在2007年《Nature medicine》的报道， T细胞受体的免疫球蛋白样结构域（G5-8蛋白），作为SEB的受体拮抗剂，能够有效治疗SEB中毒的症状，但为包涵体表达，复性后易聚集形成多聚体，活性较差。为了提高蛋白在酵母系统中有效表达，我们需要对蛋白进行优化，由于酵母表达系统对密码子的偏爱性，我们首先对G5-8蛋白的核酸序列进行了优化。优化后，各碱基（G/A/T/C）占比由27%、26%、20%、26%改变为22%、27%、31%、20%；RNA结构稳定性由优化前的-103.77kcal/mol变为优化后的-47.3kcal/mol，提高了目的蛋白的RNA在酵母系统中的稳定性，保证了蛋白稳定高效的表达。同时，在优化中注意后续核酸内切酶的使用，避开了后期用到的内切酶BamHI、BglII、EcoRⅠ、SalⅠ、XhoⅠ位点。　　由于酵母对外源生物的转录调控元件的识别和利用效率很低，所以在酵母表达系统中一般都选取酵母本身的启动子、分泌信号以及终止子。在酵母的表达系统中，许多启动子是甲醇利用途径相关的基因(methanol utilization path-way，MUT pathway)，目前已经在甲基营养型酵母中有效的表达了有几百个不同的蛋白质，特别是毕赤酵母乙醇氧化酶I AOX1基因的启动子等，因此我们选取了同样的启动子，以甲醇作为诱导剂。为了高效表达HSA-G5-8蛋白，我们构建了HSA-G5-8蛋白的双重拷贝质粒。　　通过对不同酵母菌株的诱导表达，我们得到了不同菌株表达的HSA-G5-8蛋白，之后通过ELISA体外活性实验，筛选出了表达蛋白活性相对较高的酵母表达菌株。我们对筛选得到的菌株进行大量诱导表达目标蛋白之后，通过疏水柱、脱盐柱、阴离子柱纯化得到了纯度较高的HSA-G5-8蛋白，纯度达到了95%以上，为进一步进行后续的体外评价试验和体内动物实验奠定了基础。　　在蛋白体外的活性测定实验中，我们通过生物膜干涉技术和体外细胞评价实验来检测蛋白的活性。生物膜干涉实验是利用光的干涉技术测定两个分子之间的亲和力常数，通过生物素标记的SEB分子与链霉亲合素的感受器sensor结合，来测定SEB蛋白分子与目标蛋白HSA-G5-8蛋白的亲和力大小，最终测定HSA-G5-8与SEB的KD值为7.27×10-9M，达到了nmol级别，具有较高的亲和力。　　SEB超抗原能够直接刺激人外周血淋巴细胞（PBMCs），从而引起炎症因子TNF-α、IFN-γ的大量释放。体外细胞模拟实验是通过观察加入HSA-G5-8蛋白是否抑制了SEB刺激 PBMCs释放炎症因子TNF-α、IFN-γ的含量，来评价HSA-G5-8蛋白与SEB的结合活性。我们通过淋巴细胞分离液从人全血中分离得到外周血淋巴细胞，然后将其稀释到1×106/ml，加入到24孔板，每孔1ml，同时在每孔加入SEB，终浓度为100ng/ml。在检测实验组（加入HSA-G5-8蛋白）与对照组（不加入HSA-G5-8蛋白）细胞培养液中细胞因子TNF-α、IFN-γ的含量。最终，我们发现加入HSA-G5-8蛋白后，有效的降低了SEB刺激PBMCs上清中细胞因子TNF-α、IFN-γ的释放量（P＜0.001），表明HSA-G5-8蛋白在体外能有效抑制SEB蛋白的活性，同时也发现HSA-G5-8蛋白对SEB蛋白的抑制作用呈剂量效应关系。　　在体内动物实验中，我们通过建立小鼠中毒休克模型和家兔中毒发热模型来检测HSA-G5-8蛋白与 SEB蛋白的结合活性。首先，通过我们初步的摸索，选用6~8周的雌性Balb/C小鼠，腹腔注射1ug SEB后4小时，再次腹腔注射LPS80ug/只，可以引起小鼠休克致死，从而建立了小鼠的中毒休克模型。然后，我们将HSA-G5-8蛋白在不同的时间点，以不同的方式和不同剂量的注射入小鼠体内，记录小鼠的存活时间和存活率。最后，通过比较实验组(加入HSA-G5-8蛋白组)和对照组（未加HSA-G5-8蛋白组）小鼠的存活时间和存活率，我们可以有效评价HSA-G5-8蛋白在小鼠体内的生物学活性。最终发现，HSA-G5-8蛋白与SEB共孵育注射入小鼠体内，或HSA-G5-8与SEB同时注射小鼠体内，或在SEB中毒半小时后注射HSA-G5-8救治，都能有效提高小鼠的存活时间和存活率（P＜0.01）。　　家兔对SEB较为敏感，通过静脉注射SEB入新西兰家兔体内，观察和记录实验前后几个小时之内兔肛温，分析最终数据，我们未能发现有意义的变化。寻找原因发现，家兔基础体温不稳定，肛温的检测受家兔波动影响较大，同时实验所用动物的背景值不清楚，所以未能得出有意义的结论。　　最终结论HSA-G5-8蛋白在体内外都能有效抑制SEB活性，可以作为SEB中毒救治的备选方案。