【摘 要】
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牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea,BVD)又称粘膜病,是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的一种以肠黏膜脱落为主要特征的一种呈世界性分布的传染病,早期诊断和检测是防控、净化该病的重要环节。NS3蛋白是BVDV编码的重要的非结构蛋白,保守性强,是BVDV的免疫优势蛋白。因此,利用NS3蛋白建立BVDV检测方法具有重要意义
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牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea,BVD)又称粘膜病,是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的一种以肠黏膜脱落为主要特征的一种呈世界性分布的传染病,早期诊断和检测是防控、净化该病的重要环节。NS3蛋白是BVDV编码的重要的非结构蛋白,保守性强,是BVDV的免疫优势蛋白。因此,利用NS3蛋白建立BVDV检测方法具有重要意义。主要研究内容包括:1.BVDV毒株的分离鉴定收集了实验室2019～2020年送检发病牛的9份病料,经RT-PCR检测鉴定其中3份BVDV阳性。将阳性病料进行病毒分离,盲传5代后通过RT-PCR进行验证,验证正确后继续传5代。最终本研究成功分离了一株NCP型BVDV毒株,将其命名为HB-1。通过设计全基因组引物,对基因序列进行扩增,最终得到了HB-1的全基因组序列。全基因组核苷酸序列同源性显示HB-1与ZM-95的同源性最高,为86.9%,系统发育进化树显示HB-1与BVDV-1m几个参考毒株处于同一分支,证明HB-1分离株为BVDV-1m亚型;E0、E2和NS3蛋白氨基酸序列分析结果与全基因组分型结果一致。2.间接ELISA检测方法的建立本研究通过RT-PCR扩增出HB-1的NS3基因,构建了重组表达质粒p ET-32a-NS3,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过SDS-PAGE鉴定NS3蛋白在上清中表达。经Western blot分析鉴定NS3蛋白具有反应原性。之后用纯化浓缩后的NS3蛋白作为包被抗原建立了BVDV抗体间接ELISA检测方法。NS3重组蛋白仅与BVDV阳性血清发生特异性反应,不与BRV、IBRV阳性血清发生反应,特异性良好;该方法的敏感性实验显示BVDV阳性血清在1:12800倍稀释时结果仍呈阳性,敏感性高;该方法的批内、批间变异系数均小于10%,重复性好。用建立的方法对临床收集的68份免疫血清,289份未免血清进行抗体检测,免疫血清总体阳性率95.59%,未免血清总体阳性率86.16%。建立的该检测方法为国内BVDV抗体的检测提供了技术支撑。
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