白桦BpTCP7基因的功能研究

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TCP转录因子是一类植物特有的转录因子,TCP家族成员属于螺旋-环-螺旋转录因子(bHLH)超家族成员,参与叶片和花器官的发育、维管束后生木质部导管分子的分化和形成、下胚轴形成、顶端优势等生物过程,且参与细胞分裂素、茉莉酸甲酯、生长素及油菜素内酯等激素的合成途径及应答,在植物的生长发育过程中发挥着重要作用。本研究通过分析BpTCP7基因的时空表达、启动子组织表达特性及转基因白桦的表型观测,探索BpTCP7基因的功能,研究结果如下:(1)根据白桦45个转录组数据库,获得了15条白桦BpTCP基因,分别命名为BpTCP1-BpTCPl5,其中BpTCP5为部分序列,其余14条为全长序列。通过实时荧光定量PCR的方法对15条白桦BpTCP基因进行表达模式分析,这15条基因在白桦的顶芽、嫩叶、嫩茎、雌花及雄花中均有表达,各基因之间的表达模式存在差异,也有相似之处,在顶芽、叶片和雄花中表达量相对较高,在8月中旬的叶片中相对表达量最高。(2)根据白桦基因组信息,克隆了BpTCP7基因上游1791 bp的启动子序列,并对其顺式作用元件进行了分析,构建proBpTCP7::GUS的植物表达载体,将其遗传转化入拟南芥,通过组织化学染色检测该启动子的组织表达特性,结果表明:该启动子序列中含有与组织部位表达、激素、胁迫应答等相关的顺式作用元件;通过GUS染色发现,该基因在拟南芥的营养生长阶段和生殖生长阶段均有表达,转基因拟南芥中出现剑形不规则叶片,且在不规则叶片中的表达很明显。(3)应用Gateway技术构建白桦BpTCP7基因的植物过表达及抑制表达载体,分别采用根瘤农杆菌介导的叶盘法和合子胚法进行白桦的遗传转化,并获得了4个过表达转化子和3个抑制表达转化子。通过PCR和qPCR鉴定过表达转基因植株,结果表明,白桦BpTCP7基因已经成功整合到了过表达植株基因组上,并且转基因植株的BpTCP7基因表达水平远高于非转基因对照植株。(4)对过表达转基因植株进行0.8%NaCl和20%PEG的胁迫处理,测定不同胁迫处理条件下不同株系的受害指数及SOD活性、MDA和H202含量的变化。结果表明,与非转基因株系相比,转基因株系在逆境胁迫条件下,表现出更高的抗逆能力。(5)将BpTCP7基因亚克隆至pGBKT7载体,形成BD-TCP7重组质粒,并以之为诱饵蛋白表达载体筛选白桦酵母双杂交cDNA文库。经过酵母双杂交筛选以及回转验证实验,选出了1种与BpTCP7相互作用的蛋白质。对所筛选出的蛋白质进行保守结构域分析发现:该蛋白(TCP10)属于TCP家族成员。
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