前言肝细胞癌作为全球范围内死亡率排名第三的恶性肿瘤受到多国肿瘤学家的关注。我们课题组前期的工作发现,c-Myc和EZH2双阳性的肝细胞癌具有较差的预后。microRNA发挥作用具有“一对多”的特点,探索利用microRNA进行c-Myc和EZH2双阳性肝癌的治疗具有理论和实际的意义。第一部分肿瘤中同时抑制c-Myc和EZH2表达的microRNA的筛选与鉴定【背景】已有大量文献表明c-Myc和EZH2联合高表达的肿瘤患者具有较差的预后。microRNA作为一类短链非编码RNA,广泛参与mRNA的转录后水平调控,并具有“一对多”的特点。【目的】筛选肿瘤中同时抑制c-Myc和EZH2表达的microRNA并对其进行鉴定。【方法】利用在线的多肿瘤大样本数据库,从中筛选与c-Myc和EZH2表达水平均呈现反相关的miRNA。重点在肝细胞癌中利用过表达miRNA检测c-Myc和EZH2表达水平的方法,对筛选出的miRNA进行验证。【结果】从一个包含11种肿瘤共计106例样品的数据集中筛选出15个与c-Myc和EZH2的表达水平均呈反相关的miRNA,并对其中的9个进行了Western Blot验证。结果发现仅miR-26a能够同时抑制二者的表达。随后在其他肿瘤和更多的肝相关细胞系中的检测结果也支持miR-26a能够同时抑制c-Myc和EZH2。【结论】成功筛选出了肿瘤中同时抑制c-Myc和EZH2的miRNA——miR-26a,并在肝细胞癌中进行了验证。第二部分肝细胞癌中miR-26a抑制c-Myc和EZH2的分子机制【背景】在前一部分的研究中,我们发现肝细胞癌中miR-26a能够同时抑制c-Myc和EZH2,但其具体机制尚不明确。【目的】阐明肝细胞癌中miR-26a抑制c-Myc和EZH2的分子机制。【方法】首先,我们利用生物信息学网站预测c-Myc的mRNA上可能的miR-26a的结合位点,并使用双荧光素酶报告基因检测和Western Blot等方法进行验证。其次,我们分析了c-Myc上游wnt通路中的相关分子,筛选其中可能的受到miR-26a直接调控的基因。接下来一方面,我们利用双荧光素酶报告基因检测和Western Blot等方法验证该基因与miR-26a的关系;另一方面,我们利用干涉和过表达等实验方法验证该基因与c-Myc的调控关系。最后,利用双荧光素酶报告基因检测鉴定miR-26a和EZH2的调控关系。【结果】首先,成功预测到在c-Myc的蛋白编码（CDS）区存在miR-26a的直接结合位点,双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-26a能够直接结合这一区域,Western Blot结果显示miR-26a能够抑制外源转染c-Myc的过表达。其次,筛选出wnt通路中的关键分子CDK8可能受到miR-26a的直接调控,双荧光素酶报告基因检测结果显示CDK8受miR-26a的直接调控;Western Blot结果显示,过表达miR-26a能够抑制CDK8的表达。干涉和过表达CDK8后,c-Myc的表达水平也发生同向的改变。最后,双荧光素酶报告基因检测结果显示,EZH2受到miR-26a的直接调控。【结论】在肝细胞癌中阐明了miR-26a抑制c-Myc的机制:一方面,miR-26a能够结合于c-Myc的CDS区,发挥抑制c-Myc的作用,但这种作用相对较弱;另一方面,miR-26a能够直接靶向wnt通路的关键分子CDK8,进而抑制c-Myc的转录,这种作用相对miR-26a对c-Myc的直接调控要更强。肝癌细胞中miR-26a通过直接靶向EZH2抑制其表达。第三部分肝细胞癌中c-Myc联合EZH2抑制miR-26a的表达【背景】有文献报道肝细胞癌中c-Myc能够抑制miR-26a的表达,也有其他肿瘤类型中的研究显示c-Myc能够募集EZH2联合抑制miR-26a的表达,但是肝癌中的机制并不明确。【目的】阐明肝细胞癌中c-Myc调控miR-26a的具体分子机制。【方法】首先,通过分析TCGA数据库中的资料和检测临床病例样品中成熟型miR-26a及其两个前体的表达水平,明确在肝（癌）细胞中的两个前体对成熟型miR-26a的贡献情况。其次,一方面,在BEL-7404细胞内利用包含ctdsp2（pre-miR-26a-2）启动子的p GL3质粒、c-Myc的小分子抑制剂JQ1和EZH2的小分子抑制剂DZNep进行双荧光素酶报告基因检测;另一方面,单独或联合使用JQ1和DZNep处理肝癌细胞后,qPCR方法检测成熟型miR-26a和pre-miR-26a-2的表达水平。最后,分别使用对照siRNA和c-Myc的siRNA,在c-Myc高表达和低表达的情况下进行Ch IP-qPCR检测,分析c-Myc和EZH2与CTDSP2（pre-miR-26a-2）启动子的结合情况,以及这种结合方式是否需要c-Myc的介导。【结果】首先,通过分析TCGA数据集中正常肝的RNA seq数据,我们发现pre-miR-26a-2的表达水平是pre-miR-26a-1的近千倍;利用qPCR的方法检测临床样品的结果也表明,大多数病例中,与癌旁组织相比,肝癌组织中成熟型miR-26a的表达水平均显著下调,pre-miR-26a-2的情况与成熟型相似,但pre-miR-26a-1却在多数病例中表现出了肿瘤高于癌旁的情况。其次,双荧光素酶报告基因检测结果显示,单独使用JQ1和DZNep均能够提高CTDSP2启动子的活性,联合使用后提升效果更佳;qPCR结果显示,单独使用JQ1和DZNep均能够提高成熟型miR-26a和pre-miR-26a-2的表达水平,联合使用后提升效果更佳。最后,在c-Myc高水平表达的情况下（si NC）,Ch IP-qPCR的结果表明,c-Myc和EZH2均与CTDSP2的启动子区具有结合作用;但在c-Myc低水平的情况下（si Myc）,c-Myc和EZH2的结合作用都消失了。【结论】至少在肝（癌）细胞中,pre-miR-26a-2才是真正影响成熟型miR-26a的有效前体形式,pre-miR-26a-1的作用几乎可以忽略。肝细胞癌中,c-Myc和EZH2联合抑制pre-miR-26a-2的表达,并且这种直接的抑制作用是由c-Myc介导的。第四部分肝细胞癌中c-Myc/EZH2-miR-26a双负反馈环路的阐明【背景】总结前三部分的研究,我们推测肝细胞癌中存在一个c-Myc/EZH2-miR-26a双负反馈环路。【目的】在细胞、动物和临床病例等多个水平对环路进行验证。【方法】首先,我们在肝癌细胞系BEL-7404和SMMC-7721转染成熟型miR-26a的模拟物,利用qPCR的方法检测pre-miR-26a-2的表达情况。其次,我们构建了DEN诱发肝细胞癌的动物模型,利用qPCR的方法对比了正常肝组织与肝癌组织之间、肝原位癌和肺转移癌之间环路中相关分子的表达水平。最后,我们从临床收集了典型的肝癌组织和癌旁的正常肝组织,并利用qPCR和免疫组化的方法分别检测了组织中miR-26a的表达水平和c-Myc、CDK8和EZH2的表达水平。此外,我们还分析了GEO中肝癌相关的数据集,检测环路中分子的相关关系。【结果】首先,我们在肝癌细胞系BEL-7404和SMMC-7721中过表达成熟型miR-26a后,pre-miR-26a-2的表达显著上调。其次,我们成功的建立了DEN诱发肝癌的模型,并发现在模型建立后,一方面,与正常肝组织相比,肝癌组织中c-Myc和EZH2的表达水平显著上调,miR-26a的表达水平发生下调;另一方面,与肝原位癌相比,肺转移癌中c-Myc、EZH2和CDK8的表达水平显著上调,miR-26a的表达水平明显下调。最后,我们在临床所取的典型病例中发现,与正常肝组织相比,肝癌组织中miR-26a的表达显著下调,但c-Myc、CDK8和EZH2的表达出现较高的阳性信号。此外,GEO数据集分析的结果显示,肝细胞癌中miR-26a和c-Myc、CDK8、EZH2等分子的表达均呈反向相关性。但CDK8与c-Myc的表达却呈正相关。【结论】我们在细胞、动物和临床病例等多个水平证实了c-Myc/EZH2-miR-26a双负反馈环路的存在。