猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染所引起的以妊娠母猪流产、仔猪表现神经症状及高死亡率为特征的一种传染性疾病。目前对猪伪狂犬病的防控与净化主要还是靠接种基因缺失疫苗并配合相应的血清学检测来完成。我国于上世纪70年代从匈牙利引进PRV弱毒活疫苗Bartha K61株,并在猪场中推广应用后,猪伪狂犬病疫情得到了有效的控制。但2011年以来,很多伪狂犬病疫苗免疫过的猪场,大面积爆发了伪狂犬病,原来已经净化的猪场也在短时间内变成伪狂犬病野毒阳性,给养猪业造成了巨大的经济损失。经研究发现,引发免疫猪场伪狂犬病疫情的是一种变异的PRV毒株,该变异株的毒力较经典强毒株有明显增强,且现有的疫苗不能为免疫猪群提供完全保护。因此,研制新一代针对变异株的疫苗对于控制新发伪狂犬病十分必要,且具有重要意义。1、猪伪狂犬病病毒g E/g I双基因缺失疫苗候选株的研制(1)猪伪狂犬病病毒变异株(JS-2012株)g E/g I双基因缺失株的构建:以实验室前期分离的PRV变异株(JS-2012株)为基础,将其经过两次同源重组,将主要毒力基因g E/g I进行缺失,成功构建g E和g I基因双缺失的重组伪狂犬病基因缺失株,命名为JS-2012-△g E/g I。(2)JS-2012-△g E/g I病毒的生物学特性分析:JS-2012-△g E/g I株在Vero细胞上连续传20代,未出现任何突变,表明其具有很好的稳定性。采用间接免疫荧光和Western blot进行g E蛋白表达检测,结果显示该疫苗候选株的g E蛋白成功失活。病毒生长曲线和蚀斑形态检查结果显示,JS-2012-△g E/g I与JS-2012在细胞上生长动力学相似,但JS-2012-△g E/g I形成的蚀斑要明显小于JS-2012。(3)JS-2012-△g E/g I病毒的安全性试验:结果表明,疫苗候选株对哺乳仔猪和妊娠母猪均具有很好的安全性;不能在猪群中水平传播,也不能通过母猪垂直传播;返祖试验证明该疫苗候选株不能在仔猪体内发生毒力返强。(4)JS-2012-△g E/g I病毒的免疫效力试验:免疫攻毒试验结果表明,该疫苗候选株免疫仔猪后针对PRV变异株和经典PRV强毒株攻击均能提供完全的免疫保护。被动免疫试验结果表明,该疫苗候选株免疫母猪后所产仔猪通过哺乳也能获得完全的免疫保护。2、含猪瘟病毒E2基因的重组PRV活载体疫苗株的研制(1)表达猪瘟病毒E2基因的重组PRV活载体疫苗株的构建:以本研究所构建的伪狂犬病基因缺失弱毒活疫苗(JS-2012-△g E/g I株)为骨架,经过两次同源重组,成功获得一株含猪瘟病毒E2基因的重组PRV活载体疫苗株,命名为JS-2012-△g E/g I-E2。(2)JS-2012-△g E/g I-E2病毒的生物学特性分析:JS-2012-△g E/g I-E2株在Vero细胞上连续传20代,E2基因均能在载体病毒JS-2012-△g E/g I中稳定存在,且未出现任何突变;采用间接免疫荧光和Western blot进行E2蛋白表达检测,结果证明该重组疫苗候选株中的E2蛋白在传代过程中均能稳定表达。病毒生长曲线和蚀斑形态结果显示,JS-2012-△g E/g I-E2与亲本病毒JS-2012-△g E/g I均具有高度的相似性。(3)JS-2012-△g E/g I-E2病毒的安全性试验:结果表明,重组疫苗候选株对仔猪和妊娠母猪均具有很好的安全性;该重组疫苗不能在猪群中水平传播,也不能通过母猪垂直传播。(4)JS-2012-△g E/g I-E2病毒的免疫效力试验:免疫攻毒试验结果表明,重组疫苗候选株JS-2012-△g E/g I-E2免疫阴性仔猪,能有效的抵抗PRV强毒株和猪瘟病毒强毒株的攻击,临床保护效率达100%。重组疫苗候选株免疫PRV母源抗体阳性仔猪,然后再攻猪瘟强毒,临床保护效率仍能达到80%,这表明该载体疫苗能够较好地抵抗母源抗体干扰。综上所述,本试验构建的两株伪狂犬病病毒基因工程疫苗候选株(JS-2012-△g E/g I株和JS-2012-△g E/g I-E2株),对仔猪和妊娠母猪均安全、有效,且不具备水平和垂直传播能力。同时,这两种疫苗都具有标记疫苗的特征,在临床应用过程中可利用其相应的分子标记来区分野毒感染动物与疫苗免疫动物,从而有利于净化猪群中的PRV和猪瘟病毒。如此,这两种疫苗将具有广阔的临床应用前景。