动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是一种由高热量高脂肪饮食（HFD）引起的好发于大、中型动脉的一种慢性心血管炎症性疾病,主要由巨噬细胞浸润动脉壁造成。它是全球高发病率和高死亡率的主要原因,其特征是动脉斑块的形成。此外,动脉粥样硬化可以导致包括急性心肌梗死在内的大多数心血管疾病,并导致心血管死亡率上升。有报道称,脂质积累增加在动脉粥样硬化的进展中起着至关重要的作用,已经证实氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）在动脉粥样硬化的形成和发展过程中诱导炎症反应。目前,尽管动脉粥样硬化的治疗方法取得了重大进展,但该疾病仍然是全球高发病率和高死亡率的主要原因之一。因此,探索动脉粥样硬化的分子机制,寻找新的治疗靶点、开发新的治疗方法已成为动脉粥样硬化患者亟待解决的问题。MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为21-24个核苷酸的内源性的、小的非编码RNA,可与目标m RNAs的3’非翻译区（3’-UTR）结合,其广泛参与细胞分化、增殖、稳态、血管生成和肿瘤发生等许多生物学过程的调控。此外,miRNAs已被证实在动脉粥样硬化的发展中发挥着重要作用。例如,Schober等人指出,miR-126-5p通过调节EC转换来防止动脉粥样硬化病变的形成。同时,也有学者发现miR-15a是动脉粥样硬化相关泡沫细胞形成的抗炎因子。Yébenes等人研究表明,在血管中抑制miR-217可以部分保护血管功能,缓解动脉粥样硬化。此外,Zhang等人发现靶向miR-155结合现有常规疗法可能是治疗动脉粥样硬化的有效方法。Zhang等人亦发现,对miR-144进行反义寡核苷酸治疗可能会增强心血管疾病患者的逆向胆固醇转运和氧化甾醇的代谢。Wang等人发现miR-296在动脉粥样硬化的调控中发挥了重要作用。早期的研究已表明,miR-185-5p作为一种肿瘤抑制因子在许多人类癌症中表达。然而,miR-185-5p在动脉粥样硬化疾病中的分子作用机制尚不清楚。固醇反应元件结合蛋白2（Sterol response element-binding protein 2,SREBP2）是SREBP家族的成员,是脂质代谢过程中的重要调节因子,其广泛分布于体内各种组织,主要参与胆固醇的代谢。胆固醇的生物合成和摄取在转录水平受到SREBP2的负反馈调节。近年来,越来越多的研究证明miRNAs参与调控脂质代谢相关基因。本实验首先经生物信息学分析表明SREBP2参与了动脉粥样硬化的发病机制。生物学预测分析显示,miR-185-5p可与SREBP2结合,且miR-185-5p与SREBP2之间存在靶向关系。对GSE132651数据集进行GO注释和KEGG通路分析,结果表明,DEGs在脂质代谢过程中富集。这一结论假设miR-185-5p及其靶基因SREBP2对动脉粥样硬化的影响可能是通过脂质代谢信号通路实现的。接下来,我们利用以HFD喂养的APOE-/-小鼠和以ox-LDL刺激的巨噬细胞研究了miR-185-5p对动脉粥样硬化和脂质积累的影响。我们的研究结果表明,miR-185-5p减少了动脉斑块的形成,并减少了主动脉根部组织的病变面积。同时在分子水平上,miR-185-5p通过抑制SREBP2的激活降低了脂质代谢相关基因的表达,从而证实了miR-185-5p作为一种调脂剂在临床治疗动脉粥样硬化及相关脂质代谢疾病中的关键作用。本研究将探索miR-185-5p在动脉粥样硬化中调节脂质代谢的假设作用及其潜在机制,为动脉粥样硬化疾病的治疗提供新的策略与方法。第一部分冠状动脉粥样硬化性心脏病患者外周血中SREBP2表达的研究目的:使用ELISA法检测正常对照组及冠状动脉粥样硬化性心脏病患者组外周血中的SREBP2的血清水平。阐述SREBP2在冠状动脉粥样硬化性心脏病患者外周血中的表达及变化情况。方法:1.选取实验对象。选取2020年10月至2021年1月在河北医科大学第一医院心内科住院患者。其中冠状动脉粥样硬化性心脏病（Coronary atherosclerotic heart disease,CAD）的患者共30例,均采用经皮选择性冠状动脉造影术（percutaneous coronary angiography,CAG）进行明确诊断。正常对照组30例,行CAG检查且结果显示冠脉未见明显异常者。在患者入院且未开始接受任何治疗前采集患者的外周血标本。2.使用ELISA法检测正常对照组及CAD组患者外周血中的SREBP2的血清水平。3.所有的实验数据均是采用SPSS22.0软件进行分析,且计量资料以（?）±s表示,两组数据均是采用t检验,符合P＜0.05即认为差异有统计学意义。结果:实验结果显示,冠状动脉粥样硬化性心脏病组患者血清中的SREBP2的表达量较正常对照组显著升高。小结:通过对冠状动脉粥样硬化性心脏病患者的外周血血清进行分析,发现其SREBP2的表达水平与正常对照组相比呈升高趋势。接下来,我们深入研究动脉粥样硬化性疾病的脂质调节作用机制,为动脉粥样硬化性疾病的治疗方法寻找新的思路。第二部分miR-185-5p通过抑制APOE-/-小鼠中SREBP2的激活减轻动脉粥样硬化程度并下调脂质代谢基因及炎症因子的表达目的:首先经生物信息学分析表明SREBP2参与了动脉粥样硬化的发病机制。利用以HFD喂养的APOE-/-小鼠研究了miR-185-5p对动脉粥样硬化和脂质积累的影响,并提出miR-185-5p在小鼠体内动脉粥样硬化中调节脂质代谢的假设作用及其可能机制,为动脉粥样硬化的治疗提供新的策略。方法:1.检索下载基因芯片数据,筛选差异表达基因在GEO数据库中检索动脉粥样硬化GEO表达谱数据库下载GSE-34812、GSE132651和GSE28829数据集的基因表达谱。差异表达基因（DEGs）以|logFC|＞2和P＜0.05进行差异分析。然后,利用在线维恩图工具将微阵列分析得到的重叠DEG描述为维恩图,并识别关键基因。利用targescan、miRDB、miRWalk和DIANA工具预测了针对DEG的假设miRNAs。GSE34812、GSE132651和GSE28829数据集之间的DEG通过R包中的相交函数进行识别。2.选取实验动物及分组本实验选取6-8周龄的雄性APOE-/-C57BL/6背景的小鼠。用高脂饮食（18%脂肪和1.25%胆固醇）喂养小鼠3个月,以诱导动脉粥样硬化。随后,老鼠被随机分为两组,即miR-185-5p干预组和miR-185-5p阴性对照组。12周后检测干预结果。最后,小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）安乐死并取材。3.生物信息学分析SREBP2参与动脉粥样硬化的发病机制。4.采用油红O染色方法检测HFD喂养的APOE-/-小鼠体内,miR-185-5p对血清及肝脏胆固醇水平的影响,以及是否对小鼠动脉粥样硬化的进展发挥作用。5.采用免疫组化染色、Western blotting和Q-PCR方法检测HFD喂养的apoE-/-小鼠主动脉切片中各种蛋白水平以证明miR-185-5p下调脂质代谢基因及炎症因子的表达。6.ELISA法检测小鼠肝脏匀浆和血清胆固醇水平。7.所有的实验数据均采用SPSS22.0软件进行分析,并且计量资料以x±s表示,两组数据均采用t检验的方式,且P＜0.05即认为差异有统计学意义。结果:1.SREBP2参与了动脉粥样硬化的发病机制;2.在HFD喂养的APOE-/-小鼠体内,miR-185-5p下调脂质代谢基因及炎症因子的表达;3.证实miR-185-5p可下调HFD喂养的APOE-/-小鼠的脂质代谢基因及炎症因子的表达。小结:本部分实验首先经生物信息学分析表明SREBP2参与了动脉粥样硬化的发病机制。随后,我们利用以HFD喂养的APOE-/-小鼠研究了miR-185-5p对动脉粥样硬化和脂质积累的影响,并提出miR-185-5p在小鼠体内动脉粥样硬化中调节脂质代谢的假设作用及其可能机制。第三部分miR-185-5p通过抑制体外巨噬细胞中SREBP2的激活减低脂质代谢相关基因的蛋白水平和脂质积累目的:从体外的角度来分析miR-185-5p是否会通过抑制体外巨噬细胞中SREBP2的激活从而减低脂质代谢相关基因的蛋白水平和脂质积累方法:1.细胞培养RAW264.7巨噬细胞的复苏、细胞传代以及细胞的冻存保存。2.细胞转染采用Lipo 2000TM转染试剂将miR-185-5p过表达及沉默表达的慢病毒表达载体及对照载体转染入RAW264.7巨噬细胞。3.用Western blot方法、油红O染色及免疫荧光染色法证实miR-185-5p通过干预SREBP2抑制ox-LDL刺激的巨噬细胞中脂质代谢相关基因的蛋白水平。4.用油红O染色方法检测巨噬细胞内脂滴数量。5.通过微球吞噬实验测定ox-LDL刺激的巨噬细胞中微球含量,并研究miR-185-5p对巨噬细胞吞噬能力的影响。6.所有的实验数据均采用SPSS22.0软件进行分析,并且计量资料以x±s表示,两组数据均采用t检验的方式,且P＜0.05即认为差异有统计学意义。结果:1.Western Blot方法、免疫荧光染色证实miR-185-5p通过抑制SREBP2的激活抑制脂质代谢途径。2.油红O染色法及微球吞噬实验证实巨噬细胞对ox-LDL的吞噬作用被miR-185-5p所削弱,这有助于抑制ox-LDL刺激的巨噬细胞中的脂质积累。小结:miR-185-5p通过抑制SREBP2的激活抑制脂质代谢途径,并且miR-185-5p抑制巨噬细胞的脂质积累。下调SREBP2从而诱导脂质代谢信号通路被抑制是miR-185-5p在动脉粥样硬化进展中的抑制作用的基础。结论:1.本实验通过对冠状动脉粥样硬化性心脏病患者的外周血血清进行分析,发现SREBP2的表达水平与正常对照组相比呈升高趋势,这也验证了SREBP2与动脉粥样硬化性疾病有着密切的关系。2.从体内实验得出结论,SREBP2参与了动脉粥样硬化的发病机制;在HFD喂养的APOE-/-小鼠体内,miR-185-5p下调脂质代谢基因及炎症因子的表达;证实miR-185-5p可下调HFD喂养的APOE-/-小鼠的脂质代谢基因及炎症因子的表达。3.从体外实验证明,miR-185-5p通过抑制SREBP2的激活抑制脂质代谢途径,并且miR-185-5p抑制巨噬细胞的脂质积累。下调SREBP2从而诱导脂质代谢信号通路被抑制是miR-185-5p在动脉粥样硬化进展中的抑制作用的基础。这些结论表明miR-185-5p作为动脉粥样硬化的一种新的治疗策略具有重要价值。