目的:　　 明确肺癌细胞中膜骨架连接蛋白Ezrin对体外培养的肺癌细胞系的增殖、凋亡、侵袭和转移能力的影响。并初步探讨Ezrin对肺癌侵袭转移的可能的作用机制。　　 材料　　 1、临床资料用于免疫组化的病例共183例，分别来自于辽宁省人民医院非小细胞肺癌病人外科手术切片48例，和购于上海芯超公司的组织芯片135例。所有病例中组织分型包括肺腺癌102例，肺鳞癌36例，腺鳞癌10例，支气管肺泡癌15例，大细胞肺癌10例，小细胞肺癌10例。　　 2、主要试剂兔抗人Ezrin多克隆抗体Lot＃YD071404，购于Epitomics公司。β-catenin鼠单抗购于BD公司，E-cadherin鼠单抗和内参Actin购于anta Cruz公司，Ezrin SiRNA(sc-35349)和非特异control SiRNA(sc-37007)购于Santa Cruz公司。S-P组化试剂盒购于北京中杉金桥公司。流式双染凋亡试剂盒购自北京四正柏生物技术开发公司。　　 方法:　　 1、细胞及培养　　 6种中国医科大学基础医学院病理学实验室保存的肺癌细胞系：肺腺癌细胞系A549，LTEP-α-1（以下简称LTE）和SPC-A-1（以下简称SPC）；肺巨细胞癌细胞系BEl;肺大细胞癌细胞系NCI-H460(以下简称460);肺小细胞癌细胞系NCI-H446(以下简称446)。以人正常支气管上皮细胞系HBE为正常对照。其中A549细胞系用含10％TBD胎牛血清的Hyclone DMEM培养基，其余各细胞系均用含10％TBD胎牛血清的Hyclone1640培养基。置于5％C02的37℃孵箱里培养。　　 2、SiRNA干扰　　 根据Western Blot筛选肺癌细胞系Ezrin表达量的结果，采用肺大细胞癌细胞系460和肺腺癌细胞系LTE依Santa Cruz说明书进行。并设立空白对照组和阴性对照组（即非特异的control SiRNA对照组）　　 3、Western blot收集并提取蛋白，样本进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转印到PVDF膜上。5％的脱脂奶粉或5％的BSA摇床上封闭后，加入一抗Ezrin兔多抗(1：800)，β-catenin鼠单抗(1：1000)，E-cadherin鼠单抗(1:200)，内参Actin(1：400)，4℃孵育过夜。取出孵育后的膜用相应二抗(1:4000-1:8000)室温孵育2小时后于暗室进行ECL显色。　　 4、Transwell细胞侵袭实验　　 将30ul Matrigel加入Transwell( Corning)上层小室中，置于37℃约3小时待其凝固后加入200ul含有1×105个细胞的双无培养基悬液，每组设三个平行样本。将Transwell小室置于24孔板内，每孔加500ul10％胎牛血清。常规培养16小时后取出小室，甲醛固定20分钟，稀盐酸酒精分化，自来水反蓝，二甲苯透明封片。40倍显微镜下每张片随机拍16个视野计数穿膜细胞数，取平均值进行统计学分析。　　 5、MTT实验　　 取对数生长期的细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，接种于96孔板中。每孔接种3000个细胞，常规培养。次日起每天测定一次，持续检测4天。测定时每孔加入20ul MTT溶液（5mg/ml，溶于ph7.4的PBS中，0.22um滤膜除菌），孵育4h，吸出培养液加入150ul DMSO，震荡溶解紫色结晶物10分钟，酶联免疫检测仪上测定各孔490nm波长处的吸光值。各细胞系每组因素测定时均设五个平行孔，实验共重复三次。　　 6、细胞划痕实验　　 将干扰组和对照组的细胞铺于六孔板中，用200ul枪头垂直铺满细胞的孔板做划痕，常规培养，0小时，6小时，24小时取样拍照，测量划痕宽度进行统计分析。实验共重复三次。　　 7、流式细胞凋亡实验　　 采用AnnexinV/PI法测细胞凋亡，依照流式试剂盒进行。将悬浮细胞直接收集到5ml的EP管中，每样本细胞数为(1~5)×106/mL。900~1000r/min低速离心5min，弃去培养液。用PBS缓冲液洗涤1次，900~1000r/min离心5min。用100ul的孵育缓冲液重悬细胞，室温下避光加AnnexinV和PI染料孵育20min。加400ul缓冲液轻轻混匀，上流式细胞仪检测。　　 8、RNA提取和反转录多聚酶链反应(RT-PCR)用TRIzol Reagent提取细胞总的RNA。　　 用RNA PCR试剂盒依照说明书进行目的片段的扩增。用1.5％的琼脂糖胶并加入了0.1μg/μl的溴化乙腚电泳。相对RNA的量是用目的条带与β-actin的条带相比得出的值。　　 9、免疫组织化学　　 实验前组织片子在烤片机上70℃加热4小时，按梯度进行脱水脱蜡，柠檬酸盐高温高压抗原修复2分，封闭30min，然后加入一抗Ezrin兔多抗(1：200)，E-cadherin鼠单抗(1：50)，vimentin鼠单抗(1：200)4℃过夜，二抗30min，BAD显色，苏木精染核5min，盐酸酒精分化，流水反蓝，梯度透明，封片。　　 10、统计分析　　 各组资料利用SPSS13进行统计分析。细胞系实验结果采用Independent-Samples T检验和方差分析统计分析，P＜0.05有统计学意义。　　 结果:　　 1、免疫组化结果显示：在正常肺组织中Ezrin主要表达在支气管上皮的刷状缘，肺癌组织中Ezrin的表达上调，并在肿瘤侵袭前缘的表达强于肿瘤中心部。转移处淋巴结强表达。Ezrin在肺癌中的表达强弱与病人年龄、性别、组织学分型、分化程度、临床分期均无关（P＞0.05），与淋巴结的远处转移有关（P＜0.05）。检测EMT相关指标E-cadherin和Vimentin，结果显示Ezrin与EMT过程密切相关。　　 2、划痕实验显示：干扰Ezrin后，肺癌细胞的运动迁移能力明显降低(P＜0.05）。　　 3、Transwell实验显示：干扰Ezrin后，肺癌细胞的侵袭能力明显降低(P＜0.05）。　　 4、MTT实验显示：干扰Ezrin后，肺癌细胞的增值能力明显降低（P＜0.05）。　　 5、流式细胞实验显示：干扰Ezrin后，凋亡细胞比例增加（P＜0.05）。　　 6、根据Western Blot结果，选择在A549、LTE、SPC、BE1、460和446六种肺癌细胞系中，Ezrin表达量较高的两种细胞系LTE和460，干扰其内源性Ezrin的表达，观察β-catenin和E-cadherin的蛋白表达的变化，结果显示，β-catenin蛋白表达量明显下降（P＜0.05），而E-cadherin的表达上调(P＜0.05）。　　 7、RT-PCR结果显示：干扰Ezrin后，对β-catenin和E-cadherin的转录水平均无影响（P＞0.05）。　　 结论:　　 1、Ezrin在肺癌组织中Ezrin的表达上调，并在肿瘤侵袭前缘的表达强于肿瘤中心部。Ezrin在肺癌中的表达强弱与病人年龄、性别、组织学分型、分化程度、临床分期均无关，与淋巴结的远处转移有关。　　 2、Ezrin能够上调肺癌细胞系LTE和H460体外增殖和侵袭转移能力。　　 3、Ezrin可正向调控β-catenin的蛋白表达，但对其转录无影响。　　 4、Ezrin与EMT密切相关，Ezrin过表达可上调间叶源性分子标记物vimentin的表达，抑制上皮性分子标记物E-cadherin的表达。