【摘 要】
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表观遗传是一种不改变基因组序列但可以引起染色体变化且稳定遗传的方式,包括DNA修饰（甲基化）,组蛋白修饰（甲基化,乙酰化,泛素化等）,染色质重构,组蛋白异变体,非编码RNA等。表观遗传调控影响着胚胎发育、细胞重编程等诸多生物学过程,但在人早期神经外胚层分化过程中的研究相对较少。本研究主要关注组蛋白甲基化修饰相关酶在神经外胚层分化过程中的作用,具体如下。首先设置浓度梯度优化小分子诱导的早期神经外胚层
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表观遗传是一种不改变基因组序列但可以引起染色体变化且稳定遗传的方式,包括DNA修饰（甲基化）,组蛋白修饰（甲基化,乙酰化,泛素化等）,染色质重构,组蛋白异变体,非编码RNA等。表观遗传调控影响着胚胎发育、细胞重编程等诸多生物学过程,但在人早期神经外胚层分化过程中的研究相对较少。本研究主要关注组蛋白甲基化修饰相关酶在神经外胚层分化过程中的作用,具体如下。首先设置浓度梯度优化小分子诱导的早期神经外胚层分化;对分化前后的细胞进行RNA-Seq转录组分析,发现组蛋白H3去甲基化酶KDM6B存在最显著的升高。接下来用CRISPR/Cas9技术构建KDM6家族蛋白KDM6A和KDM6B单基因的敲除以及双基因敲除人胚胎干细胞系（embryonic stem cell,ESCs）。对这些基因敲除细胞系进行早期神经外胚层分化,通过对比其分化效率和野生型（wild type,WT）ESCs分化效率的差异,发现基因敲除细胞系均比WT更容易向神经外胚层分化。同时将干细胞状态、分化第三天和分化第七天的双基因敲除细胞系以及WT细胞系进行RNA-Seq分析,其转录组差异也显示KDM6敲除的细胞能更快、更高效地向早期神经外胚层分化。其次通过KEGG分析,发现WNT/beta-catenin信号通路发生明显变化;进一步的蛋白检测显示,和WT相比,基因敲除细胞系中活化beta-catenin蛋白表达量下降,且在ESCs状态下,早期神经分化第3天和第5天WNT/beta-catenin信号通路中重要的活化基因WNT3和FZD5都有显著降低,这些数据都证明KDM6敲除可以导致WNT/beta-catenin信号通路活化被抑制。接下来,我们在早期神经分化过程中加入WNT/beta-catenin信号通路激动剂（CHIR99021）和抑制剂（IWR-1）,发现CHIR99021可以抑制早期神经分化效率,而IWR-1则可提升早期神经分化效率。更重要的是,两者均可在一定程度上回补由于KDM6敲除所导致的神经外胚层分化效率提高的表型。然后我们构建了去甲基化酶酶活结构域Jmj C突变的以及野生型的鼠源Kdm6b表达入侵病毒,在人早期神经祖细胞分化过程中加入相应病毒并在第7天检测神经外胚层分化结果,发现酶活突变的Kdm6b不能回补KDM6敲除导致的表型,而野生型的Kdm6b可以回补表型,这说明KDM6家族基因缺失促进人早期神经分化这一表型依赖于去甲基化功能。最后在早期神经外胚层分化过程中加入KDM6的小分子抑制剂GSK J1,发现GSK J1可以有效促进人ESCs以及人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,i PSCs）向早期神经外胚层的分化。综上所述,我们发现KDM6家族可以通过WNT/beta-catenin信号通路抑制人早期神经外胚层分化,且和其去甲基化修饰酶活密切相关。最后KDM6抑制剂GSK J1可提高人早期神经分化,这将为退行性神经疾病提供可能的改善方案。
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