丙酮酸脱氢酶激酶4(Pyruvate Dehydrogenase Kinase 4,PDK4)是编码具有组氨酸激酶结构域的线粒体蛋白,在脂肪代谢、糖酵解、三羧酸循环以及ATP形成等生理进程中发挥重要作用。但尚未见PDK4在山羊(Capra hircus)脂代谢中的研究报道。本实验室前期高通量测序结果显示PDK4可能与山羊脂代谢有关。因此本研究拟在克隆获得山羊PDK4基因序列并明确其表达特性的基础上,利用细胞培养、实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,q PCR)、过表达和RNA干扰等技术阐明PDK4对山羊肌内脂肪细胞脂代谢的影响以及预测其可能的调控机制。主要获得了以下的研究成果:(1)克隆获得山羊PDK4基因序列1808 bp,其中CDS为1224 bp,编码407个氨基酸残基;同时q PCR结果显示山羊PDK4高表达于肺脏与臂三头肌两种组织,极显著高于其他组织(P<0.01),且在肝脏组织中也存在较高水平的表达,同样极显著高于其他组织(P<0.01)。(2)在山羊肌内前体脂肪细胞分化过程中,PDK4 m RNA表达量随着山羊肌内前体脂肪细胞的不断分化而呈现上升趋势,在诱导分化第五天表达水平达到最高(P<0.01)。(3)干扰山羊PDK4显著降低了肌内脂肪细胞的脂滴积聚,脂质吸收及转运基因CD36、脂肪酸合成基因ACACA、甘油三酯合成基因ADRP m RNA表达极显著下调(P<0.01),同时脂质吸收及转运基因FABP3、甘油三酯合成基因AGPAT6m RNA表达水平显著下调(P<0.05)。(4)过表达山羊PDK4显著增加肌内脂肪细胞的脂质积聚,同时脂肪酸合成基因ACACA m RNA表达水平显著上调(P<0.05),脂质吸收及转运基因FABP3和CD36、、甘油三酯合成基因AGPAT6和ADRP m RNA表达极显著上调(P<0.01)。(5)利用生物信息学方法对山羊PDK4和调控PDK4的mi RNAs靶基因进行KEGG通路富集分析,取交集,获得结果显示PDK4可能通过AMPK、脂肪酸生物合成、胰岛素、脂肪酸代谢、m TOR和ECM-受体相互作用等信号通路发挥调控作用。综上所述,本研究克隆获得包括完整CDS的山羊PDK4基因序列,明确了PDK4的组织和细胞时序表达特性;功能研究显示PDK4具有促进肌内脂肪细胞脂质积聚的作用,并且这种作用可能是通过调控FABP3、CD36、ACACA、AGRAT6、和ADRP等基因的表达来进行的;此外,生物信息学分析结果显示,PDK4可能通过AMPK、脂肪酸生物合成、胰岛素、脂肪酸代谢、m TOR和ECM-受体相互作用等信号通路来调控山羊肌内脂肪细胞脂代谢。