传统中药多以水煎剂形式口服给药,中药经口服进入机体内发挥药效的物质可能不仅有原型成分,也有体内代谢产物。为了阐明中医临床常用清热中药黄芩、连翘的药效物质基础,本研究从胃肠道代谢角度出发,通过体外模拟、体内代谢研究相结合,考察黄芩、连翘水煎液及其主要成分的胃肠代谢物并对代谢产物进行抗补体、抗菌及抗内毒素活性评价,结果证明水煎液及其主要成分经肠道菌代谢后活性增强(去甲汉黄芩素/羟基酪醇)。采用伪无菌动物模型,结合代谢组学、血清药物化学及药物代谢动力学考察肠道菌群对黄芩、连翘主要成分体内代谢和吸收,结果发现并证明了肠道菌代谢产物为黄芩、连翘发挥药效的物质基础。本研究为中药药效物质基础研究以及中药现代化研究提供新的思路。1.本研究首先采用ERIC-PCR指纹图谱分析技术对常用的两种肠道菌孵育方法进行比较,确立了一种与新鲜粪便的肠道菌群结构相似且较稳定的肠道菌孵育方法。2.黄芩体外模拟人胃肠代谢及活性代谢产物的研究,发现黄芩水煎液的主要成分在人肠道菌中发生代谢,代谢后抗补体、抗菌及抗内毒素活性增强,活性最强的为代谢产物去甲基汉黄芩素。首次从黄芩药材中分离得到去甲基汉黄芩苷,对黄芩中8个主要黄酮类成分进行含量测定,黄芩苷、汉黄芩苷、去甲基汉黄芩苷、千层纸素A苷、去甲基汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A在黄芩水煎液中含量分别为110.72±4.25、35.49±2.78、7.52±0.04、16.34±0.51、1.53±0.22、39.27±2.93、12.10±0.15、3.25±0.21 mg/g生药。研究发现黄芩水煎液在人工肠液、人工胃液中稳定,没有代谢产物生成。通过UPLC-QTOF/MS分析黄芩水煎液中主要成分黄芩苷、汉黄芩苷及千层纸素A苷在人肠道菌中代谢过程发现,黄芩苷转化成苷元黄芩素以及黄芩素甲基化产物千层纸素A,汉黄芩苷转化成苷元汉黄芩素及脱甲基产物去甲基汉黄芩素,千层纸素A苷转化成苷元千层纸素A及脱甲基产物黄芩素。黄芩水煎液在人肠道菌中发生的主要代谢变化为各黄酮苷代谢生成其苷元,代谢速率较单体化合物慢。体外活性测试证明黄芩水煎液对补体系统不具有抑制作用,经肠道菌代谢后显示该作用;肠道菌代谢产物黄芩素、千层纸素a及去甲基汉黄芩素经典途径和旁路途径均对补体系统有抑制作用,且对凝血系统无显著影响,其中去甲基汉黄芩素活性(cp50=0.138±0.004mg/ml;ap50=0.147±0.008mg/ml)最强。同样,黄芩水煎液经肠道菌代谢后抗菌、抗内毒素活性增强。黄芩中主要黄酮苷类成分及相应肠道菌代谢产物抗菌活性研究表明,黄芩苷及代谢产物黄芩素、去甲基汉黄芩素、黄芩素及千层纸素a具有抗菌活性,代谢产物抗菌、抗内毒素活性强于原型黄酮苷类成分,其中抗菌活性最强的是去甲基汉黄芩素,抗内毒素活性最强的是去甲基汉黄芩素和黄芩素。去甲基汉黄芩素为黄芩经肠道菌代谢后活性最强的代谢产物,可能经体内过程富集而发挥药效。3.连翘体外模拟人胃肠代谢及活性代谢产物的研究,发现连翘水煎液的主要成分在人肠道菌中发生代谢,代谢后抗补体、抗菌及抗内毒素活性增强,活性最强的为代谢产物羟基酪醇。从连翘药材中分离得到6个化合物,分别为木脂素类成分(+)-连翘苷、(+)-松脂素-4-o-β-d-葡萄糖苷、(+)-松脂素单甲基醚-4-o-β-d-葡萄糖苷、(-)-罗汉松脂素-4-o-β-d-葡萄糖苷、(-)-松脂素单甲基醚-4-o-β-d-葡萄糖苷及苯乙醇苷类成分连翘酯苷e。对连翘药材中含量较高的苯乙醇苷类成分连翘酯苷a及木脂素类成分连翘苷、松脂素-4-o-β-d-葡萄糖苷进行含量测定,其在连翘水煎液中含量为28.37±0.03、3.74±0.02、3.512±0.01mg/g生药。研究发现连翘水煎液在人工胃液、人工肠液中稳定,没有代谢产物生成。连翘中最主要的苯乙醇苷类化合物连翘酯苷a在人肠道菌中首先水解为羟基酪醇和咖啡酸,咖啡酸在肠道菌群作用下还原生成3,4-二羟基苯丙酸。木脂素类化合物连翘苷在人肠道菌代谢作用下生成苷元连翘脂素、连翘脂素脱甲基产物lantibetin、lantibetin单键断裂产物1,2-benzenediol,4-[(2s,3r,4r)-4-[(3,4-dimethoxyphenyl)methyl]tetrahydro-3-(hydroxymethyl)-2-furanyl]和肠内脂;松脂素-4-o-β-d-葡萄糖苷在人肠道菌中代谢生成苷元松脂素、开环异落叶松脂素、落叶松脂醇、肠内脂、(2r,3r)-2,3-bis(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)butyrolactone、(-)-(2r,3r)-3-(3′′-hydroxybenzyl)-2-(4′-hydroxy-3′-methoxybenzyl)butyrolactone。连翘肠道菌代谢主要反应类型有水解、脱甲基、还原、缩合、氧化、脱羟基化;水煎液在人肠道菌代谢速率较单体成分慢。连翘水煎液对补体系统不具有抑制作用,其肠道菌代谢后样品显示该作用。木脂素类成分及相应肠道菌代谢产物不具有抗补体活性,苯乙醇苷类成分连翘酯苷a的肠道菌代谢产物羟基酪醇、3,4-二羟基苯丙酸具有抑制补体系统的作用,对凝血系统无显著影响,活性最强的是羟基酪醇(cp50=0.096±0.007mg/ml;ap50=0.121±0.012mg/ml)。同样,体外活性测试表明连翘水煎液经肠道菌代谢后抗菌、抗内毒素活性增强。木脂素类成分及相应肠道菌代谢产物不具有抗菌、抗内毒素活性;苯乙醇苷类成分连翘酯苷a及肠道菌代谢产物羟基酪醇、3,4-二羟基苯丙酸具有抑菌、抗内毒素活性,羟基酪醇活性最强。羟基酪醇为连翘经肠道菌代谢后活性最强的代谢产物,可能经体内过程富集而发挥药效,连翘药理作用的发挥依赖于肠道菌群的代谢作用,真正起作用的药效物质基础可能为经肠道菌代谢后的代谢产物而非原型成分。4.肠道菌对黄芩、连翘主要成分代谢、吸收影响研究发现,其主要成分在大鼠体内主要发生水解、葡萄糖醛酸结合、甲基化/脱甲基反应;肠道菌群可以通过影响肝肠循环/肠道菌代谢作用影响中药成分体内代谢及吸收过程。使用广谱抗生素塑造伪无菌大鼠模型,比较黄芩、连翘主要成分在伪无菌大鼠及普通大鼠肠道菌中代谢差异,结果显示肠道菌群结构紊乱影响其肠道菌代谢产物的种类及生成速率。比较黄芩、连翘主要成分在普通大鼠及人肠道菌体外代谢过程,结果显示由于人与大鼠肠道菌间存在差异,导致中药代谢产物生成速率、种类在人、鼠肠道菌代谢过程中有所不同。通过uplc-qtof/ms技术分析黄芩、连翘主要成分灌胃给予普通大鼠及伪无菌大鼠的盲肠内容物、尿液代谢产物,结果证明中药成分在普通大鼠体内主要发生葡萄糖醛酸结合、甲基化/脱甲基及水解反应,而伪无菌大鼠中没有代谢产物生成。对伪无菌大鼠和普通大鼠灌胃给予黄芩、连翘主要成分后尿液样品进行多元统计分析,筛选引起两组间尿液差异的代谢标记物。结果显示差异代谢标记物包括氨基酸代谢产物和中药成分体内代谢产物,表明肠道菌群对维持宿主健康及正常代谢具重要意义。黄芩及连翘主要成分灌胃给予伪无菌大鼠及普通大鼠后其血浆中原型成分及肠道菌代谢产物的药代动力学比较结果显示,肠道菌受到抑制后会通过影响肝肠循环、肠道菌水解作用影响中药成分及肠道菌代谢产物的体内吸收及代谢过程,进而影响药效发挥。5.复方制剂中黄芩、连翘血中移行成分研究,验证活性肠道菌代谢产物为双黄连制剂中黄芩、连翘发挥药效的活性物质基础。以双黄连(金银花、黄芩、连翘)制剂为材料进行大鼠灌胃给药、入血成分分析,证明黄芩、连翘的肠道菌活性代谢产物存在于含药血清中,验证了肠道菌群代谢作用在双黄连药效发挥过程中的关键性作用。