【摘 要】
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目的：通过新构建的假型逆转录病毒载体（VSV-G／MuLV），介导组织型纤溶酶原激活剂（tissue-type plaminogen activator，tPA）基因，转导乳鼠心肌成纤维细胞，探索心肌成纤维细胞成为tPA基因治疗靶细胞的可能性。 方法： 1、疹型口炎病毒壳G糖蛋白（VSV-G）替代MuLV的enV蛋白，从而产生一种有转染能力的以MuLV为基础的病毒载体，称为VSV-G假
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目的：通过新构建的假型逆转录病毒载体（VSV-G／MuLV），介导组织型纤溶酶原激活剂（tissue-type plaminogen activator，tPA）基因，转导乳鼠心肌成纤维细胞，探索心肌成纤维细胞成为tPA基因治疗靶细胞的可能性。 方法： 1、疹型口炎病毒壳G糖蛋白（VSV-G）替代MuLV的enV蛋白，从而产生一种有转染能力的以MuLV为基础的病毒载体，称为VSV-G假型MuLV载体（VSV-G／MuLV），通过293T／17细胞共转染质粒pCnBgSN、pHIT60（for gal-pol）和pCVG（for VSV-G），采用磷酸钙共沉淀法产生；VSV-G／MuLV病毒生产细胞293／GPG的产生；VSV-G／MuLV病毒上清的收集及滴度测定。 2、采用两次差速贴壁法（每次持续60分钟）分离、培养乳鼠心肌成纤维纤胞；通过倒置显微镜观察心肌成纤维细胞的形态学特征；用免疫细胞化学染色法（SP法）鉴定心肌成纤维细胞。 3、制备含tPA基因假型病毒载体VSV-G／tPA，通过质粒pHIT60（for gal-pol）、pCVG（for VSV-G）和pLtSN（for tPA），同时瞬时转染293T细胞产生；含tPA基因的VSV-G／tPA病毒转染293／GPG细胞，收集病毒上清并测滴度；含tPA基因的VSV-G／tPA病毒上清液转染乳鼠心肌成纤维细胞，用G418药物筛选，观察浙江大学博士学位论文转染后心肌成纤维细胞克隆形成情况;发色底物法测定转基因心肌成纤维细胞培养上清液中t队蛋白活性在基因转导后的动态变化;免疫细胞化学染色法（SP法）检测心肌成纤维细胞tPA蛋白的表达。 结果: 1、VSV--G/MuLV病毒上清滴度为6 x 106。 2、采用两次差速贴壁法分离、培养心肌成纤维细胞，细胞纯度达95%以上，形态学上完全符合心肌成纤维细胞的特征，SP免疫细胞化学染色见心肌成纤维细胞波形蛋白呈强阳性反应，即细胞浆内围绕细胞核呈棕褐色颗粒状改变，阳性率在95%以上;肌动蛋白呈阴性反应，即细胞浆内.围绕细胞核呈棕褐色颗粒状改变数在5%以下，表明已成功建立心肌成纤维细胞培养模型;‘ 3、vsv一G/t以病毒滴度为4xl护;转基因乳鼠心肌成纤维细胞G418药物筛选后约2周见克隆形成;转导t以基因的心肌成纤维细胞培养上清液中，tPA活性在转导1天后增高，2天后增高更明显，3~5天浓度达高峰。1、2天分别与3、4、5天比较均有显著性差异，1一2天之间及3~5天之间比较无显著性差异;SP法免疫细胞化学染色检测结果为转导tPA基因的心肌成纤维细胞胞浆内tPA抗原强阳性，未转导tPA基因的心肌成纤维细胞t队抗原阴性。 结论:VSV--G/MuLV载体介导的tPA基因成功转导乳鼠心肌成纤维细胞，并见有效的功能表达，表明心肌成纤维细胞有望成为基因治疗较为合适的靶细胞之一，揭示了心肌成纤维细胞潜在的合成和分泌功能，为心血管外科手术后预防血栓形成或抗血栓治疗摸索一种更为安全、有效、作用持久的治疗手段打下良好基础。
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