海洋真菌产纤溶药源产物的发酵优化与代谢调控

来源 :华东理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:liongliong536
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FGFC1是由上海海洋大学从海洋长孢葡萄穗霉FG216 (Stachybotrys longispora FG216, CCTCC NO:M2012272)的代谢产物中分离得到的一种新型小分子促纤溶活性化合物,具有潜在的抗血栓药物的开发价值。本课题旨在通过发酵过程优化、代谢调控以及发酵过程放大提高FGFC1的产量,用于后续药学研究。本文首先通过单因素实验、Plackett-Burman设计、最陡爬坡设计、响应面设计等统计学方法对培养条件及培养基组分进行优化,使FGFC1的产量由原始的0.82g/L提高到了9.13g/L,产量提高了10.1倍,实现了FGFC1的高产。其次,对FGFC1的合成途径进行了分析,并基于合成途径进行了代谢调控研究,从而使FGFC1的产量进一步提高。代谢途径抑制剂添加及前体喂养的实验结果表明,FGFC1由甲羟戊酸途径及莽草酸途径合成。在优化后的发酵培养基中添加甲羟戊酸途径和莽草酸途径的前体,结果FGFC1的产量没有明显提高,表明在优化后的发酵培养基中这些前体不是FGFC1合成的限制性因素。另外,L-鸟氨酸作为FGFC1分子结构的关键组成部分,是其合成的直接前体,因此选择了不同L-鸟氨酸添加策略对FGFC1的合成进行调控,并发现了FGFC1合成的另一关键中间代谢产物FGFC3的存在。至此确定了FGFC1合成的三种关键成分:中间体FGFC2、FGFC3以及前体L-鸟氨酸。分析发酵过程中FGFC2、FGFC3、鸟氨酸与FGFC1之间转化的关系,将FGFC1的合成过程分为了四个阶段,通过分析各阶段的代谢特征提出了一种有效促进FGFC1合成的代谢调控策略,使FGFC1的产量达到了9.92g/L,比对照组提高了16.3%。最后,进行了发酵工艺的优化及放大。通过分析摇瓶发酵以及反应器发酵过程菌体形态、溶解氧变化、pH变化及产物合成等设定了发酵过程放大原则:维持发酵过程溶解氧在30-40%,通过搅拌控制菌体形态相似,并通过补加碱液调节pH相似。依据该原则,使50L和1000 L反应器中FGFC1的产量分别达到了7.6g/L和6.57g/L,为摇瓶产量的83.9%和72.0%。随着放大规模的增加产量降低,实验现象表明发酵罐越大菌体生长越旺盛,导致次级代谢产物FGFC1的合成量降低;另外菌体形态受剪切影响从而降低FGFC1产量。该研究建立了高效的FGFC1大规模发酵工艺,有效地解决了药源短缺问题,为后续药学研究奠定了坚实的基础。
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