【摘 要】
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禽流感（Avian Influenza,AI）是由禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）引起的一种针对禽类的急性、传染性强的传染病。禽流感不仅严重危害养殖业,还对公共健康产生威胁。1.本研究通过RT-PCR的方法对2018年5月-2020年2月安徽、山东、浙江等地区采集的5192份样品进行AIV的检测。检测结果显示,AIV的总体阳性率为1.25%,采用鸡胚接种分离病毒的方
【基金项目】
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国家蛋鸡产业技术体系岗位专家项目（CARS-40-K13）；
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禽流感（Avian Influenza,AI）是由禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）引起的一种针对禽类的急性、传染性强的传染病。禽流感不仅严重危害养殖业,还对公共健康产生威胁。1.本研究通过RT-PCR的方法对2018年5月-2020年2月安徽、山东、浙江等地区采集的5192份样品进行AIV的检测。检测结果显示,AIV的总体阳性率为1.25%,采用鸡胚接种分离病毒的方法从核酸阳性样品中获得了 6株H9N2亚型AIV,2株H5N6亚型AIV。序列分析显示:6株H9N2分离株的HA裂解位点为PSRSSRGLF,符合低致病性禽流感病毒的序列特征;HA受体结合位点234位氨基酸为亮氨酸（Leu）,具有与哺乳动物唾液酸受体结合的特征;6株H9N2分离株的HA蛋白均在313位存在潜在糖基化位点。M2蛋白发生S31N突变。2株H5N6分离株的HA裂解位点为LRERRRKRGLF,符合高致病性禽流感病毒的序列特征,这2株H5N6分离株的HA蛋白未发生Q226L及G228S的突变,表明其受体结合特征仍为禽源性。遗传进化分析显示:6株H9N2分离株的HA、NA基因属于Y280-like分支,PB2、M基因属于G1-like分支,PB1、PA、NP、NS基因属于F/98-like分支。2株H5N6分离株的HA基因属于H5亚型AIV的2.3.4.4分支、NA基因属于Eurasian Lineage分支。本研究通过对2018-2020年部分地区AIV的流行株序列分析为AIV的防控提供了参考。2.构建了 H9N2亚型AIV的PA截短蛋白的原核表达载体pET-28a（+）-H9N2-sPA,表达并纯化出重组蛋白His-sPA。将重组蛋白His-sPA免疫BALB/c小鼠,随后进行免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,最后成功筛选出3株能稳定分泌抗PA蛋白的单克隆抗体细胞株1F5、4B9和8G3。抗体特性研究表明,1F5、4B9和8G3的腹水ELISA效价大于105,WB的反应结果显示1F5、4B9和8G3三株单抗均能与H9N2亚型AIV的PA蛋白反应。IFA的反应结果显示8G3能识别病毒感染的细胞,而1F5、4B9与病毒感染的细胞有微弱的反应性。同时单抗亚类鉴定表明1F5单抗重链为IgG2b,4B9与8G3单抗重链为IgG1,三株单抗的轻连均为κ链。1F5、4B9单抗所识别的抗原区域位于PA蛋白的C端505-558aa内,8G3单抗所识别的抗原区域位于PA蛋白的C端607-660aa内。单克隆抗体的通用性鉴定结果表明8G3单抗能够与H1-H13亚型的A型流感病毒的PA蛋白反应。H9N2亚型AIV的PA蛋白单克隆抗体的制备为进一步研究PA蛋白的结构与生物学功能、病毒的复制与转录奠定了基础。
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