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核酸及核苷酸具有抗氧化功能,在食品及药品领域具有很大的应用和开发潜力。DNA作为核酸的一种,近年来受到广大科研人员的关注。豆渣是一种良好的植物核酸资源,其核酸含量占豆渣干重的1%左右。对于豆渣的研究,国内外主要集中于膳食纤维、蛋白质、多糖等的提取和测定方面,尚未见有关豆渣DNA的提取及功能特性的研究。而开展豆渣DNA的相关研究对增加豆渣的附加价值及核酸资源的开发具有十分重要的现实意义。故本试验以豆渣为主要原料,研究了豆渣DNA的提取、纯化、酶解,并分析和比较了豆渣DNA与其酶解物的体内、外抗氧化活性的差异。
(1)在豆渣细胞裂解试验中,以DNA提取率为检测指标,在单因素试验的基础上,利用响应面优化法对豆渣细胞的裂解工艺参数进行了优化。确定了豆渣细胞裂解的最佳工艺条件:SDS浓度1.85%,裂解液pH值6,裂解温度81℃,裂解时间70min,液料比20∶1。在此条件下,DNA提取率达到了0.625%。
(2)在豆渣DNA纯化试验中,以蛋白质脱除率和豆渣DNA保留率为指标,比较等电点法、三氯乙酸法及高盐法纯化效果,综合考虑选择最优纯化方法——高盐法:用2/3体积的3mol/L,pH值4.8的醋酸钠进行DNA纯化,蛋白脱除率达85%,DNA保留率为83%。
(3)在豆渣DNA酶解试验中,以酶解率和羟自由基(·OH)清除率为指标,用牛胰DNA酶进行酶解,在单因素的基础上进行了四因素三水平的正交试验设计,结果表明,最佳的酶解条件为:酶解温度42℃,pH值7,加酶量3000U/g,底物浓度3%,酶解时间3.5h。在此条件下,豆渣DNA的OD260为1.57,·OH清除率为49.25%。
(4)在豆渣DNA及其酶解物的体外抗氧化试验中,主要研究了其还原能力、DPPH·清除能力、超氧阴离子自由基(O2ˉ·)清除能力及.OH清除能力。结果表明,豆渣DNA酶解前、后都具有一定的抗氧化能力,在相同浓度下,酶解后的抗氧化功效要优于酶解前,但低于Vc的抗氧化能力。DNA酶解物的还原力是DNA的2.5倍,.OH清除率是DNA的2.2倍,O2ˉ·清除率是DNA的2.1倍,DPPH.清除率是DNA的2.4倍。
(5)在豆渣DNA及酶解物的体内抗氧化试验中,以受试小鼠血清、肝脏及脑中的CAT、SOD、GSH-Px活性和MDA含量为指标,比较了豆渣DNA酶解前、后及Ve对小鼠的抗氧化作用。结果显示:豆渣DNA及酶解物都能对正常小鼠起到抗氧化的功效,小鼠体内MDA含量明显下降,CAT、SOD、GSH-Px的活性都有不同程度的升高,并存在量效关系。在相同浓度下,DNA酶解物组中SOD、GSH-Px和CAT活性的增加幅度以及MDA含量的减少幅度都明显优于DNA组,且高剂量组之间达到了显著水平(P<0.05),说明DNA酶解后的抗氧化水平明显高于DNA。且酶解物高剂量组的抗氧化水平与Ve组差异不显著(P>0.05)。证实了DNA及酶解物的抗氧化活性。