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目的:本课题研究脂代谢相关基因在汉族人群家族遗传性胆固醇结石(HCGD)患者肝组织中表达的变化,以期筛选出与HCGD发病相关基因。同时,通过对一个HCGD家系进行全基因组外显子测序(WES)探寻家系患者共有的突变基因及位点,生物信息学分析方法筛选候选基因,以期发现HCGD的致病基因或新的易感基因位点。在此基础上,探讨茵陈蒿汤配方颗粒剂(YCHD)防治C57BL/6J胆囊胆固醇结石小鼠胆石形成及可能的机制。方法:第一部分:收集9例HCGD患者(HCGD组)、9例散发性胆固醇结石患者(SCGD,SCGD组)和7例无胆石病肝血管瘤患者(对照组)血液与手术肝组织标本。采用酶法检测血清脂代谢相关指标:总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、载脂蛋白A1(Apo A1)、载脂蛋白B(Apo B)、脂蛋白Lp(a)、总胆汁酸(TBA)。采用实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)测定肝组织7个核受体(NRs):肝X受体(LXRα)、法尼醇X受体(FXR)、甾醇调节元件结合蛋白2(SREBP2)、雌激素受体α/β(ERα/β)、G蛋白偶联受体30(GPR30)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ),3个合成酶基因3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)、胆固醇7α羟化酶(CYP7A1)、胆固醇12α羟化酶(CYP8B1)和8个膜转运体基因ATP结合盒B亚家族成员4转运蛋白(ABCB4)、ATP结合盒B亚家族成员11转运蛋白(ABCB11)、顶端钠依赖性胆酸转运体(ASBT)、有机溶质转运体α(OSTα)、有机溶质转运体β(OSTβ)、胆汁酸结合蛋白(ILBP)、三磷酸腺苷结合盒转运体蛋白家族5/8(ABCG5/G8)、尼曼匹克C1样蛋白(NPC1L1)m RNA的表达。第二部分:收集一个4代共18例非近亲婚配的HCGD家系并绘制系谱图,采集HCGD家系中4例CGD患者(II3、II4、II6和III2)和1例家系内正常对照(III3)外周静脉血,采用试剂盒抽提外周血有核细胞全基因组DNA(g DNA)后进行WES,通过生物信息学分析并过滤千人基因组数据库中MAF≥1%的变异,过滤华大基因内部对照数据库以去除系统假阳性,同时过滤家系内正常对照个体(III3)中存在的突变基因或变异位点以筛选出家系内与CGD相关的候选基因/位点。筛选出的候选基因/位点通过SIFT、Poly Phen、Radial SVM、FATHMM、LR进行生物功能分析以预测变异的致病性。第三部分:40只健康雄性C57BL/6J小鼠适应性饲喂2周后,致石饲料连续喂养8周建立小鼠CGD模型。随机分为正常对照组(NG)、胆石组(LD)、胆石组+熊去氧胆酸组(LD+UDCA)、胆石组+茵陈蒿汤配方颗粒组(LD+YCHD),NG组饲喂普通饲料,其余各组均饲喂致石饲料。各实验组动物连续给药8周后内眦静脉取血、收集肝组织及胆囊胆汁标本,红外光谱分析法定性胆囊结石成分,体视显微镜观察成石状况及肝组织和胆囊胆汁大体变化,酶法检测小鼠血清脂质及胆汁脂质成分并计算胆汁胆固醇饱和指数(CSI),肝组织HE染色及油红O染色观察肝脏组织病理形态变化及肝细胞内脂质变化情况,采用q RT-PCR检测小鼠肝脏组织中核受体基因Srebp2、Erα、Erβ、Gpr30和Hmgcr m RNA的表达变化。结果:第一部分:HCGD组血清总胆汁酸(TBA)含量较对照组与SCGD组明显降低(均p<0.05),其余脂代谢相关指标各组间均无统计学差异(均p>0.05)。q RTPCR检测结果显示(1)与对照组比较,HCGD组ERα/β、SREBP2、PPARγ和NPC1L1的m RNA表达量明显升高,SCGD组FXR、OSTα和ILBP m RNA表达明显升高(均P<0.05),SCGD组CYP7A1 m RNA表达明显下降(P<0.05);(2)核受体LXRα和GPR30 m RNA,合成酶受体CYP8B1和HMGCR m RNA,膜转运体受体ABCB4、ABCB11、ASBT、OSTβ、ABCG5、ABCG8在各组间均无统计学差异(均p>0.05);(3)HCGD组中ERα和ERβm RNA表达与患者血清TBA水平呈负相关(r=-1.000,P=0.000;r=-0.989,P=0.011)。第二部分:胆固醇结石在该家系中垂直传递,每代均有发病,Ⅰ代共2例,CGD患者为1例;Ⅱ代共6例,CGD患者为2例;III代共6例,CGD患者为1例。通过WES后进行生物信息分析及逐步滤过后发现4例CGD患者(II3、II4、II6和III2)共有而家系内正常对照(III3)没有的突变基因为5个:ESPNP、SORCS2、MUC16、BAGE3、PI4KA。但未发现4例CGD患者共有的SNVs变异位点。其中,先证者(Ⅲ:2)与其姑姑(Ⅱ:6)存在5个共同的突变位点ESPNP(n.1440C>G),PI4KA(c.6083+184A>G),MUC16(c.36796-24C>T;c.37698C>T:p.Ser12566 Ser;c.40203C>T:p.Pro13401Pro);先证者(Ⅲ:2)与母亲(Ⅱ:4)存在4个共同突变位点SORCS2(c.1072-32C>T,c.3311+913C>T)、MUC16(c.20694T>C:p.His6898His,c.36067+50C>A);先证者(Ⅲ:2)与其父亲(Ⅱ:3)和姑姑(Ⅱ:6)存在1个共同突变位点MUC16(c.41946-168A>G);Ⅱ:3和Ⅱ:6具有共同的突变位点BAGE3(c.14T>C:p.Val5Ala)。发现先证者(Ⅲ:2)MUC16基因2个错义突变(c.38224A>T:p.Thr12742Ser),SIFT=0预测为具有危害性;MUC16(c.40204A>C:p.Lys 13402Gln),Poly Phen2=0.974预测为具有危害性。MUC16基因和SORCS2基因是否为HCGD致病基因还有待于进一步的验证。通过功能分析,我们猜测MUC16基因为候选致病基因的可能性大。第三部分:体视显微镜观察显示NG组成石率为0%(0/10),LD组成石率为100%(10/10),UDCA及YCHD干预组成石率分别为30%(3/10)和40%(4/10);红外光谱分析法定性为胆固醇结石。与NG组相比,LD组小鼠体质量、血清TG和TC水平、胆囊胆汁胆固醇(Ch)、胆汁磷脂(PLs)和胆固醇饱和指数(CSI)均明显升高(均P<0.01);血清HDLC和TBA水平,胆汁胆汁酸(BAs)水平显著降低(均P<0.01);LDL-C未见明显差异(p>0.05)。与LD组相比,UDCA组和YCHD组小鼠体质量、血清TG和胆汁CSI均明显降低(均P<0.01),血清TBA、胆汁PLs和BAs均明显升高(均p<0.05),UDCA组TC和LDL-C未见明显差异(均p>0.05);YCHD组血清TC和TG明显降低(均p<0.05),HDL-C和LDL-C未见明显差异。连续给药8周后,HE染色和油红染色O显示,与NG组相比,LD组肝组织轻度脂肪变和炎性细胞浸润;与LD组相比,UDCA组和YCHD组肝组织脂肪变性减轻,炎性细胞浸润减少。q RT-PCR结果显示:与NG组相比,LD组Erɑ和Hmgcr m RNA表达明显升高(均P<0.01),Gpr30 m RNA表达明显降低(p<0.05),Erβm RNA表达无显著性差异(p>0.05);与LD相比,UDCA组Gpr30 m RNA表达明显升高(P<0.01),Srebp2、Erα、Erβ和Hmgcr m RNA表达无显著性差异(p>0.05)。YCHD组Srebp2和Erɑm RNA表达明显降低(均p<0.05),Erβm RNA表达明显升高(P<0.01),Gpr30和Hmgcr m RNA表达无显著性差异。结论:1、核受体基因ERα/β、SREBP2、PPARγ及膜转运体基因NPC1L1在HCGD患者肝组织中表达上调,其高表达可能参与了HCGD的发生发展。其中,SREBP2、PPARγ在HCGD发病与SCGD发病中可能存在不同的调控机制。肝脏中“ESRɑ-SREBP-2”的调节通路可能参与了HCGD的发生。2、MUC16、SORCS2基因可能是HCGD家系的一个新的致病基因,新突变位点MUC16(c.3 8224A>T/p.Thr12742Ser)和MUC16(c.40204A>C/p.Lys 13402Gln)的检出丰富了MUC16基因的突变谱。3、YCHD通过“ERα-SREBP2”途径,下调ERα和SREBP2 m RNA的表达,改善肝脏的病理性损伤及肝内脂质沉积,调节血脂中HDL-C和TG,降低胆汁Ch和CSI和升高BAs,改善胆汁致石性从而防治小鼠CGD形成。