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研究背景在法医物证实际工作中,相当数量的生物检材来源并不是单一的,混合斑的存在,因其不确定的来源人数和各成分的混合比例,带给了物证工作较大的实验方法上和解释方面的困难。位于常染色体上的短串联重复序列(Short tandem repeat,STR)因其广泛的分布性和良好的多态性,已成为所有现代法医物证实验室的常规检测目标。近二十年来,对于混合斑STR分型结果的解释方法经历了从单纯基于峰高、峰面积等似然比判断法,到更客观科学的统计学方法如贝叶斯理论的转变,但是不同解释方法标准不同,且西方法庭科学对有些解释过程存疑。此外,普通STR分型时,混合比例超过10:1的混合斑中次要成分的扩增会受到主要成分的面具效应(Mask effect),使得次要成分分型结果无法读取。另一方面,为了加大不同混合成分之间的可检测的区别,法医学发展应用了更多更灵敏的遗传标记,比如Y-STR、单核苷酸多态性位点(Single nucleotide polymorphism,SNP)、插入缺失多态性(Deletion-insertion polymorphism,DIP)等,极大的提高了鉴别混合斑中次要成分的能力。但是DIP、SNP等由于其自身多态性的限制,只能作为补充检测,无法普遍应用。近几年,Castella V等人提出了一种联合遗传标记DIP-STR,其集合了STR良好的多态性和DIP的敏感性,仅用普通STR分型检测设备成功检测到1 000:1混合斑中的次要成分。2013年,Wang L等人应用扩增阻滞突变系统(Amplification refractory mutation system,AMRS)原理成功实现用三条引物将SNP联合STR在一个聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)中特异性扩增,因此,我们可以探索SNP-STR联合遗传标记在不平衡混合斑中的应用前景。为了实现效能的评估,我们需要建立一个SNP-STRs复合扩增体系,并检验其在不同比例混合斑中的实际鉴别能力。目的构建SNP-STRs复合扩增体系并探索SNP-STR联合遗传标记在不平衡混合斑中应用的可行性。方法(1)查阅数据库和文献资料,按照以下标准,筛选靶目标:(1)STRs各位点之间连锁平衡,且STRs是已经报道过多态性较好的位点;(2)SNP位点位于常色体上STR位点上游或者下游200bp范围内;(3)SNPs位点在中国汉族人群中最小等位基因频率≥0.15;(4)各位点有效信息基因型概率I≥0.2225。(2)根据AMRS原理,利用Primer 3软件设计目标位点的引物,并测试每组引物特异性。(3)构建复合扩增体系:(1)通过调整引物浓度或改变引物序列,排除或者降低复合扩增体系引物之间的相互影响;(2)调整峰高(2ng标准品,杂合子峰高1 000-3 000RFU,纯合子峰高3000-6000RFU)。(4)复合扩增体系对于单源性DNA灵敏度检测。(5)利用350个湖北汉族无关个体,调查复合扩增体系的群体数据。(6)用不同血源DNA,模拟案件最常见的双源性混合血斑,并设置不同浓度混合比,测试复合扩增体系检测混合斑次要成分的灵敏度。结果(1)挑选出8个连锁平衡的SNP-STRs位点并加上性别基因组成一个复合扩增体系。(2)所有位点在湖北汉族人群中均有较好遗传多态性,且每个位点统计结果均符合哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium)。(3)复合扩增体系对单源性DNA灵敏度可达0.05ng,对双源性混合斑可检测次要成分的混合比是20:1。(4)部分位点的可检测比例高于20:1,最高可达1 000:1。结论本文成功构建了新型联合遗传标记SNP-STRs复合扩增体系并肯定了其应用在不平衡混合斑的实际鉴别能力。