论文部分内容阅读
目的：在NMDA诱导的兴奋性神经毒细胞模型中，观察SIRT1发挥保护作用的信号通路。背景：沉默信息调节因子2相关酶1（silentinformationregulator2homolog1,SIRT1）是Sirtuin家族的成员之一，广泛存在于哺乳动物细胞中。SIRT1参与多种生命过程，如基因转录、组蛋白去乙酰化、细胞周期调节、糖脂代谢、细胞氧化应激和抗衰老等。近年来，有关SIRT1的神经保护作用受到人们越来越广泛的关注。本研究室的研究结果也显示，在NMDA诱导的神经损伤模型中，激动SIRT1或使SIRT1高表达均可以发挥神经保护作用。以往研究表明，p53、FOXO3a、HICl、E2F1等因子在转录水平对SIRT1的表达起调控作用，miRNA、HuR等因子可以在转录后水平对SIRT1的表达进行调控，AROS、DBCl、DYRKlA和DYRK3、MST1等可以在翻译水平调控SIRT1的表达。但是对于SIRT1发挥作用的胞内信号机制并未明确。以往报道显示，在氧化应激模型中，HuR蛋白磷酸化可以使SIRT1蛋白表达下调。此外，胞内PKC活化后可能使HuR发生磷酸化。而PKC作为一种Ca2+依赖的蛋白激酶，当被胞内Ca2+激活后，可以通过使底物蛋白磷酸化而发挥调节作用。已知突触后膜NMDA受体过度激活引起胞外Ca2+大量内流，最终导致细胞损伤甚至死亡。基于本研究室前期实验已经证实，SIRT1在NMDA诱导的兴奋性神经毒中发挥保护作用。由此我们推测：Ca2+–PKC–HuR–SIRT1途径可能是调控SIRT1表达，影响SIRT1功能发挥的重要信号通路。内容和方法：本研究主要包括三部分实验，（1）观察HuR磷酸化通过对SIRT1的影响在兴奋性神经毒中发挥的作用。在NMDA诱导的神经毒细胞模型中，应用CCK-8分析、乳酸脱氢酶（LDH）检测、Calcein-AM/PI双染、Westernblotting（WB）、RT-PCR、免疫沉淀（IP）、酶活性检测等方法，观察HuR蛋白的磷酸化水平对SIRT1和兴奋性神经毒的影响；（2）观察PKC激酶活性通过对HuR的影响在兴奋性神经毒中的作用。在NMDA诱导的神经毒细胞模型中，应用上述方法，观察PKC激酶活性对HuR磷酸化水平和兴奋性神经毒的影响；（3）观察Ca2+对PKC激酶活性的影响在兴奋性神经毒中的作用。在NMDA诱导的神经毒细胞模型中，应用上述方法，观察钙螯合剂BAPTA对PKC激酶活性和兴奋性神经毒的影响。结果：1、NMDA引起HuR蛋白磷酸化水平增加了45.5%（P<0.05），SIRT1mRNA水平降低了36.33%（P<0.05），SIRT1蛋白表达量减少了7.37%（P<0.05），SIRT1酶活性降低了36.48%（P<0.05），细胞活力降低了28.28%（P<0.05），LDH释放增加了48.14%（P<0.05），活细胞数减少了27.89%（P<0.05）。在HuR突变细胞中（突变了PKC作用的磷酸化位点，抑制了HuR的磷酸化），NMDA组的HuR蛋白磷酸化水平增加了20.61%（P<0.05），SIRT1mRNA的水平降低了15.61%（P<0.05），SIRT1蛋白水平降低了20.90%（P<0.05），SIRT1酶活性降低了34.17%（P<0.05），细胞活力降低了7.92%（P<0.05），LDH释放增加了17.70%（P<0.05），活细胞数减少了9.63%（P<0.05）。以上结果提示：在NMDA诱导的兴奋性神经毒模型中，HuR可能通过其磷酸化使SIRT1mRNA、SIRT1蛋白水平及其酶活性发生下调。2、NMDA组的PKC激酶活性增高了97.53%（P<0.05），HuR蛋白磷酸化水平增加41.40%（P<0.05），细胞活力降低了48.20%（P<0.05），LDH释放增加了69.09%（P<0.05），活细胞数减少了58.19%（P<0.05）；与对照组相比，PKC抑制剂组的PKC激酶活性增高了44.06%（P<0.05），HuR蛋白磷酸化水平增高了13.70%（P<0.05），细胞活力降低了19.29%（P<0.05），LDH释放增加了19.75%（P<0.05），活细胞数减少了17.80%（P<0.05）；与NMDA组相比，PKC抑制剂组的PKC激酶活性降低了48.43%（P<0.05），HuR蛋白磷酸化水平降低了30.92%（P<0.05），细胞活力恢复了48.89％（P<0.05），LDH释放减少了28.26%（P<0.05），活细胞数增加了76.37%（P<0.05）。以上结果提示：在NMDA诱导的兴奋性神经毒模型中，激活PKC可能使HuR发生磷酸化，由此引起细胞损伤。3、与NMDA组相比，钙螯合剂BAPTA组的PKC激酶活性降低了65.60%（P<0.05），细胞活力增加了88.66％（P<0.05），LDH释放减少了39.91%（P<0.05），活细胞数增加了45.09%（P<0.05）。已知NMDA引起的Ca2+内流是导致其兴奋毒性作用的关键因素，因此我们推测：NMDA可能通过介导Ca2+内流而激活PKC。结论：在NMDA诱导的兴奋性神经毒细胞模型中，NMDA引起胞外Ca2+内流，胞内增高的Ca2+激活PKC，活化的PKC使HuR磷酸化，磷酸化的HuR与SIRT1mRNA结合减少，从而使SIRT1mRNA稳定性降低、SITR1表达下调，引起细胞损伤甚至死亡，即Ca2+–PKC–HuR–SIRT1途径可能是调控SIRT1功能发挥的信号通路。