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研究背景:血管内皮细胞通过产生和释放多种生物活性物质调节血管的功能和血供。内皮功能紊乱（endothelial dysfunction,ED）与多种心血管疾病的发生密切相关,如高血压、动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）、糖尿病等。引起内皮功能障碍的因素有很多,在其中发挥关键作用的是氧化应激造成的活性氧（reactive oxygen species,ROS）的增强。氧化应激造成的内皮功能障碍常伴随内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）活性降低和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）活性增加。一氧化氮（nitric oxide,NO）及其衍生物可以通过对蛋白质的半胱氨酸进行巯基亚硝基化修饰（S-nitrosylation）而起到调节蛋白质的作用。蛋白质的巯基亚硝基化修饰可通过影响蛋白质的生物活性以及表达、亚细胞定位、分子间相互作用等参与蛋白质功能调控。β-连环蛋白（β-catenin）是一种多功能蛋白质,经典Wnt信号通路的激活能促进β-catenin进入细胞核,使T细胞因子/淋巴细胞增强因子（T cell factor/lymphocyte enhancing factor,TCF/LEF）转录活性增加,进而增加促炎因子的表达,加重动脉粥样硬化性内皮细胞功能障碍。有研究表明,在内皮细胞中eNOS和β-catenin之间存在双向交叉调节;然而,eNOS和β-catenin之间的相互作用对内皮功能紊乱的影响及机制尚无报道。研究目的:本研究主要探讨eNOS和β-catenin的相互作用对内皮功能障碍的影响,阐明发挥作用的机制,并明确蛋白质巯基亚硝基化修饰在其中起到的关键调节作用。研究方法和结果:细胞实验:在培养的原代人脐静脉内皮细胞（humanumbilical vein endothelial cells,HUVECs）和EA.hy926内皮细胞上,用氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,ox-LDL,100μg/mL）处理造成内皮功能障碍,加或不加NOS抑制剂L-NAME、iNOS特异性抑制剂1400W处理。采用DHE荧光探针检测细胞内ROS水平,采用划痕实验检测内皮细胞的迁移功能,RT-PCR检测粘附分子ICAM-1、VCAM-1的mRNA水平,结果显示,ox-LDL显著增加内皮细胞内超氧化物水平,增加内皮细胞迁移以及增加粘附分子ICAM-1、VCAM-1的mRNA水平。免疫共沉淀结果显示,ox-LDL明显增加内皮细胞中eNOS与β-catenin的结合;提取细胞核蛋白行Western blot检测eNOS与β-catenin的核转位情况,结果显示ox-LDL可明显增加内皮细胞中eNOS与β-catenin的核转位;荧光素酶报告基因检测显示ox-LDL增强β-catenin的转录活性;Western Blot实验表明ox-LDL显著降低细胞内eNOS丝氨酸1177（Ser1177）位点磷酸化水平,增加iNOS活性;用硝酸还原酶的原理、化学发光法检测显示ox-LDL显著增加细胞内总NO含量;采用巯基亚硝基化检测试剂盒,并通过生物素转换（Biotin-switch）的方法检测,结果发现ox-LDL明显增加内皮细胞中eNOS巯基亚硝基化修饰（S-nitrosylation）水平。用NOS抑制剂L-NAME、iNOS特异性抑制剂1400W显著降低ox-LDL引起的eNOS巯基亚硝基化修饰增加、eNOS与β-catenin结合增加;使用iNOS抑制剂1400W预处理内皮细胞后,显著抑制ox-LDL引起的eNOS与β-catenin核转位增加、粘附分子ICAM-1和VCAM-1的mRNA水平增加以及内皮细胞迁移的增加。在人胚肾（Human Embryonic Kidney,HEK）293细胞上转染野生型eNOS或其突变质粒S1177A（丝氨酸1177位突变为丙氨酸,该位点不能被磷酸化,即无活性的eNOS）、S1177D（丝氨酸1177位突变为天冬氨酸,模拟Ser1177位点磷酸化,即有活性的eNOS）后,裂解细胞进行免疫共沉淀,发现与野生型相比,转染S1177D显著减少β-catenin与eNOS的结合,而转染S1177A明显增加二者的结合。此外,使用野生型eNOS或其突变质粒Cys94s（将eNOS半胱氨酸94位点突变为丝氨酸）、Cys99s（将eNOS半胱氨酸99位点突变为丝氨酸）过表达内皮细胞,与野生型相比,Cys94s、Cys99s明显逆转ox-LDL引起的内皮细胞中eNOS巯基亚硝基化修饰增加、eNOS与β-catenin结合增加,同时也逆转ox-LDL引起的内皮细胞eNOS与β-catenin的核转位、β-catenin的转录激活、内皮细胞迁移速度及粘附分子ICAM-1和VCAM-1的mRNA水平。动物实验:选取8周龄、雄性载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠,给予高脂饲料（high fat diet,HFD）喂养4周,构建动脉粥样硬化血管内皮损伤模型,野生型C57BL/6J小鼠正常饮食作为对照。油红O染色检测主动脉根部斑块,免疫荧光法检测主动脉内皮细胞中eNOS和β-catenin的定位情况以及β-catenin靶蛋白c-myc的水平,结果显示,与野生型小鼠相比,ApoE-/-小鼠血管内皮细胞核中eNOS和β-catenin表达增加,且β-catenin下游靶蛋白c-myc表达增加。结论:ox-LDL可通过增加内皮细胞内iNOS表达、上调NO合成,从而增加eNOS半胱氨酸位点Cys94、Cys99的巯基亚硝基化修饰水平,降低eNOS的活性,导致低活性的eNOS与β-catenin结合增加,eNOS与β-catenin核转位增加。转核后的eNOS活性降低,而核内的β-catenin激活其共转录因子TCF/LEF及其靶基因c-myc的活性,从而介导内皮功能紊乱。这一发现提示,干预eNOS与β-catenin的结合可能为防治内皮功能紊乱提供新的靶点,为心血管疾病的防治提供新思路。