背景:目前,全球有近1.8亿人感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV),而在中国约1000万为抗-HCV阳性。HCV至今尚缺有效的疫苗。依据Simmond系统,HCV可分为7个基因型和85个确定的以及20个待定的基因亚型。对HCV基因型分布及分子流行病学的研究,有助于控制HCV的播散。最新研究表明,中国HCV基因型以1b为主,占56.8%(582/997);其次为2型、3型和6型。但是,中国的南北地区HCV基因型组成和播散趋势不尽一致。与北方不同,6a在华南地区已经取代2a成为当地的第二个主要流行的HCV基因亚型,并曾在广东河源发生快速流行。海南岛毗邻广东省,主要居民为汉族(83.33%),其次是黎族(14.73%)。至今对海南岛的HCV分子流行病学研究较少。此外,海南黎族族源研究显示,其与南岛语系的多个族群有明显遗传渊源关系,其被称为“人类进入东亚入口的古老活化石”。至今HCV基因型6的各个亚型主要发现在东南亚地区流行。HCV基因型6因其遗传差异最大,亚型最复杂,已被视为HCV的最古老的病毒株,目前仍不断地发现新的HCV基因型6特殊病毒株——指不能归入已知的亚型的病毒株。HCV基因型6特殊病毒株由于病毒载量低、遗传差异大和缺乏参照序列,因此对该类病毒进行全长扩增是世界难题。前期研究发现部分来源于海南黎族的HCV基因型6病毒起源古老且独特。因此,对海南黎族的HCV基因型6特殊病毒株进行全长扩增,研究海南黎族的HCV基因型6与东南亚其他地区该型病毒的进化关系,将有助于补充该型病毒的生活史研究。目的:1.本研究首先通过研究海南省汉族和黎族人群中的HCV基因型分布和临床特点、高危因素来了解海南省HCV的感染概况。2.应用系统发育树分析(phylogenetic anlynasis)来了解海南汉族地区HCV的来源、传播模式和规律。3.从黎族中的HCV基因型6特殊病毒株中,对两株未知的病毒株HN1316和HN1350进行了全基因组扩增和测定。进一步分析黎族“HCV基因型6特殊病毒株”与东南亚地区的HCV基因型6毒株的进化关系。方法:1.样品来源:纳入2013.1～2014.6间收集的HCV-RNA阳性慢性HCV感染者血清标本246例(其中汉族176例,黎族70例)。基因的扩增和测序:巢式PCR扩增并测序Core-E1。数据分析:应用系统发育树分析海南汉族和黎族人群中HCV基因型的分布特点。2.应用BEAST 1.6软件和贝叶斯—马尔科夫链—蒙特卡洛(Bayesian—MCMC)方法对海南汉族与中国其他地区汉族的HCV序列进行种系地理学分析。最后,扩大海南汉族的慢性HCV感染者的病例数至402例,检测其基因分型,系统分析这些患者的流行病学特点和临床特点,Logistic回归分析海南地区HCV感染的高危因素。3.设计简并引物及特异性引物,通过“DNA walking on bridges and islands”策略进行多片段PCR扩增并测定两株未知的黎族病毒株——HN1316和HN1350的全基因组序列。继而采用生物信息学软件,进行核苷酸相似性分析,构建ML(Maximun Likelihood)系统进化树以估算它们的系统进化位置,进行基因重组测定分析,来确定新的基因亚型。结果:1.海南省汉族人群的HCV流行概况:(1)海南省汉族的163例样本基因型分布为:6a是最主要的亚型,其次是1b、3b、3a、2a和 1a:6a为 33.7%(55/163),1b为 33.1%(54/163),3b为 14.7%(24/163),2a 为 6.7%(11/163),3a 为 8.6%(14/163)和 1a 为 3%(5/163)。(2)种系地理学分析发现:海南的HCV与中国其它地区汉族的HCV交替分布于每一簇中。进而,扩大至402例后的检测基因型分布、流行病学特点和临床特点如下:(3)6a仍是最主要的亚型,其次是1b、3b、3a、2a和1a。(4)Logistic分析表明:海南HCV传播的高危因素分别是使用过污染的医疗器械(P<0.05)、使用血制品(P<0.05)和静脉吸毒(P<0.01);卡方检验显示6a亚型中静脉吸毒明显高于其他亚型(P<0.01)。2.海南省黎族58例的基因型分布为:基因型6为94.8%(55/58),1b为1.72%(1/58)、2a 为 1.72%(1/58)、3b 为 1.72%(1/58)。进一步对 55 例HCV 基因型 6 分析发现:6a 为 3.5%(2/58),6xa 为 3.5%(2/58),6w 为 5.2%(3/58),6e 为 1.7%(1/58),6v 为 1.7%(1/58),6r 为 1.7%(1/58),特殊病毒株为77.6%(45/58)。系统发育树分析显示这45株病毒明显有别于东南亚其他地区的病毒株而集聚为独立的进化簇。3.成功对HN1316和HN1350成功进行全基因组扩增。分析发现:两个病毒株与其他已知的6型全长序列的基因相似性在70～80%;接着构建ML系统进化树发现,HN1350与印度尼西亚、香港地区发现的6g、6w有着共同的祖先,HN1316与6a、6b、6xd和6_ZS202、老挝地区发现的6_L373有着共同祖先。进一步分析发现无明显流行病学关联的三个病毒株:HN1350(全长)、HN1314和HN1411三个序列之间基因差异在7.6～14%。结论:1.6a是海南汉族中最主要的感染基因型,其次为1b,提示6a在我国可能已经开始从广东地区快速传播开来。海南岛虽然与大陆隔海相望,但是海南省汉族人群同属于中国大陆汉族的HCV传播网络。2.海南黎族人群的HCV以基因6型为主,并发现多株基因6型的特殊病毒株且高度聚集,提示HCV基因型6病毒可能在黎族地区封闭地缓慢传播了非常长的时期。3.首次在黎族中发现一个HCV基因型6的新亚型。基因相似性结果显示HN1316和HN1350属于HCV基因型6,但不能归于已知亚型;这两个病毒株与东南亚周边地区来源的病毒有共同祖先,提示海南黎族可能是HCV基因型6起源的一部分;本研究中有三株病毒满足新基因亚型命题条件,可以命名一个HCV基因型6新亚型(6xg?),联系HCV命名委员确认新命名的工作在进行中。