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目的:缺血性脑血管病是常见病、多发病,病死率和致残率均较高,需要细胞启动多种防御机制,提高抗凋亡及修复能力,以保护神经元免受由此带来的损伤。目前已知一些转录因子与神经细胞的存活相关,其中最重要的是环单磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)家族。CREB在神经系统中的功能实现,最终依赖于其下游基因在时间和空间上精确的转录调控机制。这些基因广泛参与突触传递、细胞结构、信号转导、基因转录以及代谢等多方面。在一些脑缺血及再灌注模型中,多种应激刺激通过细胞内信号转导途径使CREB第133位的丝氨酸磷酸化而激活。磷酸化的CREB(phosphorylated CREB, phospho-CREB)直接或间接激活相关基因的转录,进而表达某些蛋白分子如c-fos、bcl-2以及某些神经营养因子如碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经生长因子(Brain-Derived Neurotrophic Factor, BDNF)等。这些基因产物调节着神经元在应激性损伤后的再生、存活和修复。尽管CREB可以和其靶基因结合并激活其表达,但激活效应活性较低,往往需要和一些共激活因子相互作用协调发挥激活效应。CREB活性调节转导子(Transducers of regulated CREB, TORCs)是新发现的一类强有力的CREB的共激活因子。近年来,其对CREB / BDNF通路的调控作用已成为热点之一。它主要受胞内Ca2+和cAMP的双重调节,促进了CREB下游基因转录的效率和突触传递中的长时程增强效应。因此,TORC1作为TORCs的一个亚型,在缺血性脑血管病中是否同CREB一起共同实现其神经保护作用,有待进一步研究,并挖掘其潜在的优势。丹参酮ⅡA(Tanshinone IIA, TSA)是临床上常用的中草药丹参的一种脂溶性有效成分,除了对心肌、脑血管和肝脏的抗炎、抗氧化作用以外,还以其类雌激素生物效治疗更年期综合征等。本实验基于成功建立大鼠大脑中动脉闭塞模型,在此基础上:①测定脑缺血急性期不同时间点大鼠缺血脑皮质中TORC1、phospho-CREB及BDNF的表达水平,以进一步探索TORC1在脑缺血后通过phospho-CREB在促进下游基因表达中的调节作用;②通过丹参酮ⅡA的应用,观察其对脑含水量、神经功能缺损评分、脑梗死体积及TORC1、phospho-CREB及BDNF表达的影响,从而探讨TORC1、phospho-CREB及BDNF的表达与脑保护作用之间的关系,及丹参酮ⅡA脑保护作用的可能机制,为临床治疗提供更为有利的理论依据。方法:实验分为两部分:实验一,TORC1、phospho-CREB及BDNF在大鼠脑组织中的动态表达。实验二,丹参酮ⅡA的脑保护作用研究。实验一,采用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠,随机分为正常组(normal)和模型组(middle cerebral artery was occluded, MCAO),参照Longa等的线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉闭塞模型,分别在术后3 h,6 h,12 h,24 h,48 h,72 h进行评分,2、3、4或5分者纳入实验组,评分完毕将动物断头处死,留取病变侧脑组织,利用免疫组织化学和蛋白印迹法方法测定TORC1、phospho-CREB及BDNF在蛋白水平的动态表达。实验二,采用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠,随机分为假手术组(sham)、溶剂对照组(vehicle-control)、丹参酮ⅡA小剂量(10 mg/kg)组(TSA-L)及丹参酮ⅡA大剂量(20 mg/kg)组(TSA-H)。MCAO术后立刻腹腔注射丹参酮ⅡA溶液(10 mg/kg或20 mg/kg),分别在术后24 h时进行评分,完毕将动物断头处死,留取病变侧脑组织进行脑含水量测定,采用2% 2,3,5-三苯基四唑氮红(triphenyltetrazolium chloride, TTC)染色观测梗死体积,免疫组织化学、蛋白印迹法(Western Blot法)和半定量逆转录多聚酶链反应法(RT-PCR方法)测定TORC1、phospho-CREB及BDNF的表达情况,以及应用激光共聚焦显微镜观测TORC1在不同组间脑皮质神经元的表达和核转导。结果:1 MCAO组术后各时间点TORC1、phospho-CREB及BDNF的表达,均分别有两个高峰,第一个高峰均在脑缺血后3 h,phospho-CREB及BDNF的第二个高峰在缺血后72 h,TORC1的表达和核转录的第二个高峰在缺血后48 h。与normal组相比,TORC1,phospho-CREB和BDNF高峰时的表达均有统计学差异(P < 0.05)。2神经功能评分:实验二中,MCAO后24 h采用改良的6分法进行行为学评分。与vehicle-control组相比TSA-H组明显改善了神经功能症状缺损(P < 0.05),TSA-L组中没有观测到如此明显的结果。3脑组织含水量测定:sham组为78.50%±0.7%,vehicle-control组为84.57%±0.51%,与其相比,TSA-H组降低了脑组织含水量(82.16%±0.63%),且有统计学差异(P < 0.05)。而TSA-L组与对照组比较没有统计学意义(P >0.05)。4梗死体积的测定:与vehicle-control组(%HLV: 43.54%±3.22%)相比,TSA-H组明显降低了梗死体积(%HLV : 34.49%±1.39%),且有统计学差异(P < 0.05);TSA-L组与vehicle-control组相比,无统计学差异(P > 0.05)。5丹参酮ⅡA对TORC1、phospho-CREB及BDNF表达的影响:与Vehicle组相比,TSA-H组中TORC1、phospho-CREB及BDNF在蛋白水平表达明显升高(P < 0.05),尤其是TORC1的核积累显著增加,同样,TORC1及BDNF在mRNA水平表达也明显升高(P < 0.05);而TSA-L组表达无此明显差异。激光共聚焦显微镜技术显示:与Vehicle组比较,TSA-H组中TORC1在神经元胞核和细胞质中的聚集反应显著增加。结论:TORC1、phospho-CREB及BDNF在大脑中动脉闭塞后早期被诱导表达,TORC1可能仅在脑缺血后48 h前参与了促进了phospho-CREB / BDNF通路的活化。高剂量丹参酮ⅡA干预后,脑含水量降低,梗死体积减小,神经功能症状缺损评分降低,上调了TORC1、phospho-CREB及BDNF的表达水平,对脑缺血后脑组织有保护作用。本研究提示TORC1 / CREB /BDNF信号通路参与了丹参酮ⅡA的脑保护作用,为丹参酮ⅡA的临床应用提供了理论基础。