第一章 HMGB1/RAGE信号轴在大鼠急性下肢缺血再灌注损伤中的变化1 研究背景与目的急性下肢缺血损伤由下肢动脉管腔突然闭塞导致,是血管外科常见的急重症之一。尽管目前诊治技术较前明显进步,但急性下肢缺血治疗后并发症发生率、死亡率和肢体丢失率仍然很高。尽快恢复缺血肢体的供血是恢复肢体正常功能的必要条件,但恢复供血后发生的应激反应又可诱发缺血组织的再一次损伤,称之为缺血再灌注(Ischemia/reperfusion,IR)损伤。IR会导致机体不同程度的损伤,从轻度损伤到伴随全身炎性反应综合征的系统性反应,可累及多个器官。下肢缺血再灌注损伤是一系列复杂的炎性应答过程,常见的炎性因子包括白介素(Interleukin,IL)、细胞间黏附分子(Intercellular adhesion molecule,ICAM)、血管细胞黏附分子(Vascular cell adhesion molecule,VCAM)、粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF-α)、单核细胞趋化蛋白 1(Monocyte chemoattractant protein 1,MCP1)等。在此过程中,血管组织不可避免的发生炎症反应,引起上述炎症因子变化,导致血管舒缩功能障碍,血管壁通透性增高,白细胞聚集和微血栓形成,从而加重IR损伤,因此减轻供应下肢的血管本身的炎症反应,保护血管的结构和功能,有利于减轻下肢IR损伤。高迁移率族蛋白B1(High mobility group box protein 1,HMGB1)通过被动和主动方式自细胞核内释放至胞外参与缺血再灌注损伤,与早期炎症介质相比,HMGB1水平的升高发生较晚,因此被认为是一种晚期炎症因子。本课题组前期的研究表明,HMGB1在急性肢体缺血再灌注中通过诱发和维持炎症瀑式反应破坏血管组织的结构和功能,但在缺血再灌注的血管损伤中HMGB1与哪些受体结合,介导怎样的信号传递仍不清楚。在细胞膜上HMGB1主要有两个受体,晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)和 Toll 样受体 2/4(Toll-like receptors 2/4,TLR 2/4)。但RAGE与HMGB1亲和力更高,是HMGB1的主要受体。HMGB1/RAGE信号轴激活RAGE依赖的信号转导机制,比如MAPK通路,以此活化核转录因子(nuclear factor kappa B,NF-κB)介导炎症瀑式反应,在脑、肝脏、肾脏等组织缺血再灌注损伤中发挥重要作用,但其在下肢缺血再灌注过程中血管损伤中的分子机制未有报道。FPS-ZM1是RAGE特异性阻断剂,能够阻断RAGE与HMGB1的结合并抑制两者结合所介导的信号传递。本研究将采用FPS-ZM1对下肢缺血再灌注的大鼠进行预处理,探索HMGBl/RAGE信号轴在大鼠急性下肢缺血再灌注损伤中的分子机制,为HMGB1依赖的炎症信号在急性下肢缺血再灌注损伤中的研究提供新的数据支持。2 方法将24只雄性SD大鼠随机分为三组:假手术组(Sham)、缺血再灌注组(IR)和IR+FPS-ZM1组。模型构建成功后收集组织样本,H&E染色和EVG染色检测组织病理变化,qRT-PCR检测股动脉HMGB1和RAGE mRNA表达,western blot检测 HMGB1、RAGE、P38、p-P38、ERK1/2、p-ERK1/2、P65、p-P65、IKBa、p-IKBa、NLIRP3、P65核定位的蛋白表达情况;同时,收集大鼠血液样本,ELISA检测血清中HMGB1、IL-6和TNF-α表达。3 结果1)H&E和EVG的病理切片分析结果显示,IR损伤能够诱导大鼠股动脉中炎症因子大量分泌以及胶质纤维及弹性纤维损伤降解,并干扰内皮细胞存活。抑制剂FPS-ZM1处理则能够明显抑制由IR诱导产生的股动脉损伤。2)IR损伤能够显著上调血清中HMGB1,TNF-α和IL-6的表达,但FPS-ZM1预处理仅能够明显抑制IR后TNF-α和IL-6的表达。3)IR损伤能够显著提高大鼠股动脉组织中HMGB1和RAGE的表达,FPS-ZM1预处理则对HMGB1和RAGE表达上调无显著影响。4)IR 损伤能够显著促进 p-P38、p-ERK1/2、p-P65、p-IKBa、NLRP3 的表达及P65的核定位,而FPS-ZM1处理则能够显著抑制IR损伤引起的NF-κB信号通路中效应因子表达及活性的变化。4结论下肢缺血再灌注后,大鼠股动脉组织HMGB1和RAGE表达显著上升,炎症应答上调,血管损伤加重。FPS-ZM1阻断RAGE与HMGB1结合能够显著抑制大鼠下肢缺血再灌注后炎症应答水平及MAPK信号通路活性,抑制NF-κB活化,破坏炎症应答信号通路的正反馈机制,从而减轻组织损伤,但对HMGB1/RAGE的表达无明显影响。第二章 HMGB1与RAGE相互作用介导炎症应答调控HR诱导血管内皮细胞损伤1 研究背景与目的血管内皮细胞(Vascular endothelial cell,VEC)是血管平滑肌和血液之间的机械屏障,同时在机体信息传递、平滑肌收缩、血管通透性及凝血功能调控方面发挥重要作用。研究表明,血管内皮功能损伤是缺血再灌注损伤的扳机点,血管内皮功能损伤导致NO释放水平下调,NO分泌下降后和化学趋化剂一起募集中性粒细胞、黏附分子等富集于损伤内皮细胞上,诱导进一步的血管损伤。研究血管内皮细胞在缺血再灌注诱导的细胞损伤中的分子功能变化,有利于进一步明确HMGB1/RAGE促炎信号轴在下肢缺血再灌注诱导的血管内皮细胞损伤中的作用机制。本研究中采用人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)为研究对象,采用低氧复氧(Hypoxia/reoxygen,HR)模型模拟体内缺血再灌注过程,研究FPS-ZM1对HMGB1/RAGE促炎信号轴的调控作用及后续炎症对内皮细胞损伤的影响。2 方法HR处理HUVEC模拟体内缺血再灌注损伤。采用不同浓度的FPS-ZM1处理HUVEC后,检测细胞存活能力,选择合适的FPS-ZM1细胞处理浓度,随后将细胞分组为:对照(Control)、HR、HR+FPS-ZM1 三组,qRT-PCR检测 HMGB1和RAGE表达,Co-IP实验检测HMGB1与RAGE的相互作用,Hoechst实验检测细胞损伤,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫荧光检测P65和NLRP3的定位及表达,western blot 检测细胞中 HMGB1、RAGE、P38、p-P38、ERK1/2、p-ERK1/2、P65、p-P65、IKBa、p-IKBa、NLIRP3 的表达以及 P65 核定位情况,ELISA 实验检测细胞培养上清中HMGB1、IL-6和TNF-α表达。3结果1)梯度浓度FPS-ZM1预处理HR后检测HUVEC生存发现,1.0 nM FPS-ZM1能够显著抑制HR后HUVEC的存活,而0.5nM的浓度没有表现出对内皮细胞存活明显的抑制。因此,我们选用0.5 nM作为本次研究FPS-ZM1的处理浓度。2)CCK-8实验结果显示HR能够显著抑制HUVEC的增殖,而FPS-ZM1预处理能够部分逆转HR的抑制效果。3)流式细胞术及Hoechst实验结果显示,HR能够显著促进HUVEC的损伤和凋亡,而FPS-ZM1预处理能够部分逆转HR诱导的细胞损伤和凋亡。4)ELISA实验检测结果显示,HR组细胞培养上清中HMGB1、TNF-α和IL-6的表达显著上调,但FPS-ZM1预处理进能够显著抑制HR后TNF-α和IL-6的上调而对HMGB1表达无影响。5)Co-IP实验研究结果显示HMGB1蛋白能够直接结合RAGE蛋白,FPS-ZM1预处理则能够显著抑制两者之间的结合。6)免疫荧光显示,HR后P65的核定位和NLRP3的表达显著增加,而FPS-ZM1预处理则能显著抑制该过程。7)Western blot 检测显示,HR 处理后 HUVEC 中 p-P38、p-ERKl/2、p-P65、p-IKBa、NLRP3表达及P65核定位显著上调,而FPS-ZM1预处理则能显著逆转以上蛋白的表达或定位。4结论HR处理能够显著上调HUVEC中HMGB1、RAGE、炎症因子表达及信号通路的活性,诱导细胞凋亡。FPS-ZM1预处理则能够通过阻断HMGB1与RAGE结合抑制其介导的炎症信号,进而缓解缺氧再灌注对HUVEC造成的损伤,减少细胞凋亡。第三章 HMGB1/RAGE促炎信号轴介导HR诱导的HUVEC自噬1研究背景与目的自噬是细胞对胞内、外环境变化的一种应激反应,正常情况下自噬维持在基础水平,在维持细胞内稳态方面发挥重要作用。过度自噬可能会造成细胞结构及功能受损,导致自噬性死亡的发生。研究表明,缺血再灌注过程中,细胞的自噬水平被显著提高,提示其可能在缺血再灌注损伤中发挥重要作用。为进一步探讨HMGB1/RAGE促炎信号轴在缺血再灌注诱导的细胞自噬过程中的生物学过程,本研究中采用自噬抑制剂3-MA和自噬诱导剂雷帕霉素分别干预HR诱导下的HUVEC,分析其对HUVEC中HMGB1、RAGE及炎性因子的表达及细胞的自噬的影响。2方法HR处理HUVEC模拟体内缺血再灌注损伤后,采用自噬抑制剂3-MA、自噬诱导剂雷帕霉素(RAPA)和FPS-ZM1处理细胞,将细胞分组为:control、HR、HR+3-MA、HR+FPS-ZM1 和 HR+FPS-ZM1+RAPA 五组。qRT-PCR 检测细胞中 HMGB1 和 RAGE mRNA 表达,western blot 检测细胞中 HMGB1、RAGE蛋白及自噬标志物LC3 Ⅰ/Ⅱ、Beclin 1、NLRP3、TNF-α、IL-6及P62表达。透射电镜观察细胞中自噬小体形成,免疫荧光检测LC3B表达,ELISA实验检测细胞培养液中IL-6和TNF-α的表达。3结果1)HR损伤后IL-6和TNF-α表达显著升高,3-MA及FPS-ZM1处理则能够部分抑制IL-6和TNF-α表达,而FPS-ZM1和雷帕霉素共同处理则能明显上调IL-6和TNF-α表达。2)qRT-PCR和western blot的检测结果显示,HR损伤后HUVEC中RAGE和HMGB1的表达均显著上调,而3-MA及FPS-ZM1预处理均对HR细胞的RAGE和HMGB1表达无显著影响,同时FPS-ZM1预处理之后再用RAPA诱导自噬后对RAGE和HMGB1表达亦无显著影响。3)HR 损伤能够显著上调 HUVEC 中 LC3 Ⅱ、Beclin Ⅰ、NLRP3、IL-6 和 TNF-α表达而下调P62的表达,3-MA或FPS-ZM1处理能够部分逆转上述结果,而FPS-ZM1和雷帕霉素共同处理细胞则进一步增强HR诱导的细胞自噬水平。4)HR损伤后HUVEC中自噬小体显著增加,而3-MA或FPS-ZM1处理能够减少自噬小体,FPS-ZM1和雷帕霉素同时处理则显著增加HR后HUVEC中自噬小体的数量。5)免疫荧光结果也显示,IR损伤后LC3B表达明显上调,3-MA或FPS-ZM1处理能明显降低LC3B的表达,而FPS-ZM1和雷帕霉素同时处理则能进一步增强HR损伤后细胞LC3B的表达。4结论低氧复氧损伤后内皮细胞中的HMGB1、RAGE、炎症因子水平及自噬活动明显增强,抑制HMGB1/RAGE促炎信号轴能够显著抑制低氧复氧 引起的细胞炎症反应及自噬活动,提示HMGB1/RAGE促炎信号轴通过介导细胞炎症反应促进缺血再灌注诱导的细胞自噬。