头孢菌素类抗生素是抗感染药物中最重要的一类，具有广谱抗菌活力、高效力、低毒性、水相中高稳定性等优势，在医药卫生各个领域都有占有巨大的市场。临床用半合成头孢类抗生素基本上都是β-内酰胺类抗生素母核7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，7-ACA)和去乙酰基-7-氨基头孢烷酸(Deacetyl-7-ACA，D-7-ACA)3-位和7-位侧链的衍生物。7-ACA和D-7-ACA生产方式分为化学法和酶法裂解顶头孢霉发酵产物头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)7-位的α-氨基己二酰基侧链和3-位的乙酰基侧链。化学法需要大量有机试剂和重金属催化剂、在强酸、强碱和低温等极端条件进行，对环境污染严重、设备要求严格、能耗高，因此逐渐被环境友好、操作简易、能耗低的酶法生产工艺所替代。酶法生产7-ACA工艺分为双酶法和单酶法。双酶法生产7-ACA是通过三角酵母的D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase，DAAO，EC1.4.3.3)和假单胞菌的戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶(glutaryl-7-ACA acylase，GLA，EC3.5.1.93)介导的催化过程。双酶法主要问题在于反应中产生的过氧化氢会对酶造成失活，解决这个问题最有效的手段为开发一步转化CPC到7-ACA的头孢菌素C酰化酶(Cephalosporin C acylase，CPCA)。7-ACA经过头孢菌素C脱乙酰基酯酶(Cephalosporinacetyl esterase，CAE，EC3.1.1.41)或化学法可将3-位乙酰基去除，得到另外一种新型的中间体D-7-ACA。鉴于酶法合成7-ACA和D-7-ACA的优越性和重要性，本论文对固定化GLA和CPCA的开发工艺、催化工艺和ClassⅠ GLA的定向进化展开研究:　　(1)高水平表达GLA和CPCA策略研究:通过特异性基因组挖掘，从假单胞菌NK703获得ClassⅠ GLA基因，随后基于表达系统，诱导剂类型及诱导条件、发酵培养基组分及培养条件和补料策略的组合优化，实现ClassⅠ GLA的高水平表达。优化条件下，重组菌pET-28b+GLA/BL21(DE3)发酵72h菌体密度和酶活分别达到32.94±1.016和14.47±0.465U/mL，时空生产力达到200U L-1h-1。3.7L发酵罐放大发酵72h，菌体密度和酶活分别达到54.42±1.442和12406±521U/L，发酵水平为报道最高值。使用基因优化合成手段获得ClassⅢ N176 GLA，同时引入有利氨基酸突变将其改造成CPCA，并构建重组菌pET-28a+CPCA/BL21(DE3)。同样使用上述GLA优化后的合成培养基，发酵48h菌体密度、酶活和比活分别达到18.75±0.86U/mL、25.5±2.36和9.277±1.16U/mg，证明GLA表达策略同样适用于CPCA。　　(2) GLA和CAE化学渗透提取研究:为使重组GLA和CAE从大肠杆菌中得到有效释放，采取化学渗透提取方法。对提取试剂进行筛选，观察不同类型的去污剂、金属螯合物和有机试剂等对目的蛋白释放率的影响，结果显示:在一定离子强度下，使用溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)可以将重组GLA有效释放，而使用TritonⅩ-100可将重组CAE有效释放。对化学渗透处理条件进行研究发现:渗透试剂浓度、温度、离子强度和时间都会对提取效果产生影响。最终确定最佳提取条件，重组GLA释放率达到110％，比活提高了1.47倍，证明是一种有效的GLA选择性提取方法。重组CAE释放率达到103％，但比活没有进一步增加。　　(3)固定化GLA和CPCA制备及性质研究:为获得高性能的固定化GLA和CAE，对GLA和CPCA固定化工艺进行系统性研究和优化。首先建立硫酸铵部分纯化和回收方法，使用30％(w/v)和27％(w/v)硫酸铵可有效的将GLA和CPCA回收，纯化倍数分别为1.24和1.08，酶活回收率分别为89.1％和91.1％。使用氨基和环氧基型固定化树脂对载体进行筛选并优化，结果显示:环氧基EP为最佳固定化载体。固定化GLA酶活为120U/g，总酶活回收率达到33.3％。固定化CPCA酶活为115U/g，总酶活回收率达到25.2％。相比于游离酶，固定化GLA和CPCA的温度和pH耐受性都有不同程度加强，说明本实验中选择的固定化手段可以有效的加强酶稳定性，从而提高其在生物催化过程中重复能力。　　(4)酶法合成7-ACA和D-7-ACA工艺研究:从催化效率、操作稳定性和生产力对使用固定化DAAO和GLA的“双酶两步法”和使用固定化CPCA的“单酶一步法”工艺催化CPC到7-ACA进行比较研究，结果显示:“双酶两步法”在催化时间，7-ACA产率和生产力都明显优于“单酶一步法”。“双酶两步法”催化CPC到7-ACA，反应85min，CPC转化率达到97.3％、7-ACA产率达到70.29％和8.2％α-K-7-ACA残留，以及部分未知副产物。“单酶一步法”催化CPC到7-ACA，反应15min，CPC转化率达到99.5％、7-ACA产率达到85％、以及部分的未知副产物。“单酶一步法”7-ACA时空生产力比“双酶两步法”提高近20倍。固定化DAAO、GLA、CPCA和CAE操作半衰期分别为111h、35h、18h和534h。随后，基于固定化CPCA和CAE催化CPC到D-7-ACA混合级联反应，研究“双酶一锅法”D-7-ACA生产工艺，结果显示:反应15min，D-7-ACA产率达到64.6％、CPC转化率为99.8％、以及部分的未知副产物，相比于“双酶双步法”生产效率提高近2倍。“双酶一锅法”相比于传统的“三酶三步法”，在酶制剂成本、工艺路线和生产效率等方面有大幅度提高，具有一定工业应用价值。　　(5)定向进化ClassⅠ GLA到CPCA:基于ClassⅢ SE83 S12突变株改造经验对ClassⅠ NK703 GLA定向进化。结合氨基酸序列比对和文献结果确定F58β为突变起始位点。然后构建饱和突变文库，筛选结果显示:突变株F58βN比野生型CPC特异性酶活提高4倍。但第二轮突变中没有获得CPC特异性活力进一步提高的双突变株，表明已经选为第二轮饱和突变的氨基酸位点在底物和酶形成的复合体稳态中有着一定作用，所以不同类型氨基酸替换会导致催化氨基酸Ser与CPC酰胺键结合能力下降，导致CPC特异性活力下降。