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目前肿瘤免疫治疗的研究重点集中在打破肿瘤免疫耐受和提高效应性T细胞反应。各种类型的肿瘤疫苗和过继性细胞免疫治疗逐渐进入临床应用阶段,并取得了阶段性的成果。其具有代表性的治疗如树突状细胞(dendritic cells, DCs)疫苗和体外培养的各类效应性T细胞的过继回输。然而在临床实践中,特别是对于那些已长成的血管化实体瘤,其单独应用的实际总体有效率均未超过30%。故目前国内外的肿瘤免疫治疗多停滞于Ⅰ、Ⅱ期临床试验。这是因为肿瘤微环境中复杂多变的免疫抑制网络限制了免疫治疗的实际效果,其中的抑制因素是困扰肿瘤免疫治疗的关键。近年来随着肿瘤免疫基础研究的发展,虽然仍未完整阐明肿瘤的免疫抑制网络,但其中的重要节点——CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)的作用日益受到重视。在荷瘤机体内,CD4+CD25+FOXP3+Treg数量明显升高。越来越多的证据表明了无论在肿瘤环境下还是在抗肿瘤免疫中,Treg都扮演了负面角色。荷瘤机体内Treg的增加成为肿瘤免疫耐受,导致肿瘤免疫逃逸和限制肿瘤免疫治疗疗效的重要原因之一。所以对Treg进行针对性地调控成为肿瘤免疫治疗的重要环节。目前在欧美日等发达国家,调控Treg的措施已进入临床试验阶段,而国内的相关研究基本处于极少量的临床前实验阶段。环磷酰胺作(cyclophosphamide, CTX)为常规化疗药,被广泛应用于临床。CTX除了直接的细胞毒作用以外,还同时具有免疫调节方面的功能。近年来国外相关动物实验研究证实低剂量的CTX能够选择性地删除CD4+CD25+FOXP3+Treg,其删除作用具有时间和剂量依赖性。目前较一致的研究结果认为单次应用CTX后3-4天,Treg数量下降至最低水平,7天后逐渐恢复至正常水平。但CTX的应用都局限为单次给药,且有关CTX的最佳剂量、与免疫治疗的具体联合方式不尽相同。单次应用CTX(single administration)清除Treg的时间是短暂的,而在临床的免疫治疗中多为连续或循环应用疫苗或过继回输效应性T细胞,如果能够延长抑制Treg的时间(即在连续的免疫治疗时间段内保持Treg的相对低水平)可能将取得更好的效果。为此本研究以黑色素瘤的C57BL/6荷瘤小鼠为模型,筛选出CTX能够清除Treg的最佳剂量；采用循环应用CTX (cyclical administration),即间隔规律的多次给药方式,观察其对Treg的调控作用,能否延长对Treg的抑制时间；观察循环应用CTX联合DC疫苗和/或CTLs过继免疫治疗的抗瘤效果；同时观察自身免疫病的发生情况。第一部分循环应用低剂量环磷酰胺对荷瘤小鼠Treg的影响目的：观察循环应用低剂量CTX对荷瘤鼠Treg的影响，从免疫调节的角度探讨CTX的抗瘤作用。方法：通过皮下接种瘤细胞制备黑色素瘤荷瘤鼠模型；以25mg/kg到200mg/kg的剂量对小鼠腹腔注射CTX,流式细胞术检测小鼠脾脏中CD4+CD25+FOXP3+Treg的比例,筛选出CTX的最佳剂量；以最佳剂量腹腔注射CTX,每隔7天给药一次,共3次；应用流式细胞术检测Treg的变化,同时观测小鼠肿瘤的大小,绘制肿瘤生长曲线；培养小鼠骨髓来源的树突状细胞(DCs),将DCs与脾T淋巴细胞混合培养,应用ELISA法检测T淋巴细胞干扰素-γ(IFN-γ)的分泌量。结果：1、随着荷瘤时间的延长,荷瘤鼠脾脏CD4+CD25+FOXP3+/CD4+比例逐渐升高,至荷瘤后14d明显高于对照组(P<0.05)。2、当CTX的剂量为100mg/kg时,荷瘤鼠CD4+CD25+FOXP3+/CD4+比例明显降低(P<0.05)。3、单次应用CTX抑制Treg的时间较短,而循环应用CTX能够延长对Treg的抑制,维持其在相对较低水平(P<0.05)。4、循环应用CTX显著提高了荷瘤鼠脾T淋巴细胞IFN-γ的分泌水平(P<0.05),其中负载肿瘤细胞裂解物的DCs组(TL-DC)明显高于未负载肿瘤细胞裂解物的DCs组(Unpulsed DC)(P<0.05)。5、单次应用CTX和循环应用CTX均未能延缓肿瘤生长,均未导致免疫性白斑及明显化疗毒副反应。结论：1、随着肿瘤的生长进程,荷瘤鼠脾脏中Treg比例逐渐升高。2、对于C57BL/6J小鼠,CTX能够删除Treg的最佳剂量可能是100mg/kg。3、循环应用CTX能够使Treg在较长的时间里维持在相对较低水平,循环应用CTX更具有实用价值。4、循环应用CTX能够更加有效调控Treg,从而促进DCs对T淋巴细胞的抗原特异性激活,这将会提高DCs疫苗或过继性细胞免疫治疗的抗瘤效果。第二部分循环应用低剂量环磷酰胺联合树突状细胞疫苗的抗瘤作用目的：观察低剂量循环应用CTX联合树突状细胞疫苗的实际抗瘤效果,并探讨其中可能的机制。方法：通过皮下接种瘤细胞制备黑色素瘤荷瘤鼠模型,并于体外培养制备负载肿瘤抗原的DCs (TL-DCs)疫苗。根据不同的CTX给药方式,将小鼠随机分4组：①循环CTX+DCs疫苗治疗组；②单次CTX+DCs疫苗组治疗；③单纯DCs疫苗治疗组；④单纯循环CTX治疗组。联合治疗的方式为在腹腔注射CTX (100mg/kg)后4天,瘤周皮下注射TL-DCs疫苗。绘制肿瘤生长曲线和小鼠生存曲线。采用ELISA法检测各组小鼠血清IFN-γ水平,并应用免疫组化染色观察小鼠淋巴结内的CD8+T细胞。结果：1、循环CTX+DCs疫苗治疗组的抑瘤作用最为明显,与单次CTX+DCs疫苗组、单纯DCs疫苗治疗组和单纯循环CTX组比较均有统计学意义(P<0.05)。2、循环CTX+DCs疫苗治疗组的累积生存率和平均生存期明显高于其它各组,其差异均有统计学意义(P<0.05)。3、循环CTX+DCs疫苗组小鼠的血清IFN-γ水平均明显高于其它各组,其差异均有统计学意义(P<0.05)。4、循环CTX+DCs疫苗治疗组淋巴结内CD8+细胞数量和平均光密度值均高于其它各组,其差异均有统计学意义(P<0.05)。5、应用CTX的各治疗组中均未见免疫性白斑等自身免疫病及明显化疗毒副反应结论：1、循环应用低剂量CTX通过规律调控Treg,能显著提高DCs疫苗的疗效,为CTX调控Treg的基础上联合DCs疫苗免疫治疗的临床应用提供必要的理论依据。2、循环应用低剂量CTX联合DCs疫苗治疗未导致自身免疫病的发生,是安全可靠的。第三部分循环应用低剂量环磷酰胺联合CTLs过继免疫治疗的抗瘤作用目的：观察低剂量循环应用CTX联合CTLs过继免疫治疗的实际抗瘤效果并探讨其中可能的机制。方法：通过皮下接种瘤细胞制备黑色素瘤荷瘤鼠模型。体外培养制备肿瘤抗原特异性的CTLs,用CCK-8法检测CTLs的体外杀伤效力。根据不同的CTX给药方式,将小鼠随机分4组：①循环CTX+CTLs治疗组；②单次CTX+CTLs治疗组；③单纯CTLs治疗组；④单纯循环CTX治疗组。联合治疗的方式为在腹腔注射CTX 100mg/kg)后4天,鼠尾静脉注射CTLs。绘制肿瘤生长曲线和小鼠生存曲线。采用ELISA法检测各组小鼠血清IFN-y水平。结果：1、TL-DCs诱导的CTLs对B16细胞具有强烈的杀伤作用,其杀伤率(76.4±11.4)%远高于对CT26细胞(15.3±6.5)%和BGC-823(9.8±4.3)%细胞的杀伤率,也高于对照CTLs对B16细胞(35.2±7.8)%的杀伤率(P<0.05)。2、循环CTX+CTLs组的抑瘤作用最为明显,与单纯循环CTX组、单纯CTLs治疗组单次CTX+CTLs组比较均有统计学意义(P<0.05)。3、循环CTX+CTLs治疗组的累积生存率和生存期明显高于其它各组,其差异均有统计学意义(P<0.05)。4、循环CTX+CTLs组小鼠的血清IFN-y水平均明显高于其它各组,其差异均有统计学意义(P<0.05)。5、应用CTX的各治疗组中均未见免疫性白斑等自身免疫病及明显化疗毒副反应。结论：1、循环应用低剂量CTX通过规律调控Treg,能显著提高CTLs过继免疫治疗的疗效,为CTX调控Treg的基础上过继性细胞免疫治疗的临床应用提供必要的临床前理论依据。2、低剂量循环应用CTX联合CTLs过继免疫治疗未导致自身免疫病的发生,是安全可靠的。第四部分循环应用低剂量环磷酰胺联合DCs疫苗、CTLs过继免疫治疗的抗瘤作用目的：观察低剂量循环应用CTX调控Treg的基础上联合DCs疫苗和CTLs过继免疫治疗的实际抗瘤效果,并探讨其中可能的机制。方法：建立黑色素瘤荷瘤鼠模型,制备负载肿瘤抗原的DCs (TL-DCs)疫苗及肿瘤抗原特异性的CTLs。根据不同的CTX给药方式和不同的联合方式,将小鼠随机分4组：①循环CTX+DCs疫苗+CTLs治疗组；②单纯DCs疫苗+CTLs组；③循环CTX+DCs疫苗组；④循环CTX+CTLs组。联合治疗的方式为在腹腔注射CTX 100mg/kg)后4天,瘤周皮下注射TL-DCs疫苗,同时鼠尾静脉注射CTLs。绘制肿瘤生长曲线和小鼠生存曲线。采用ELISA法检测各组小鼠血清IFN-y水平。观察各组荷瘤鼠免疫性白斑的发生情况及化疗的毒副作用。结果：1、循环CTX+DCs+CTLs组取得最佳的抑瘤效果,与其它各组比较均有统计学意义(P<0.05),而单纯循环CTX+CTLs组、循环CTX+DCs疫苗组和单纯DCs+CTLs组的抑瘤效果则基本相同,其差异均无统计学意义(P＞0.05)。2、循环CTX+DCs+CTLs治疗组的累积生存率和生存期高于其它各组,其差异均有统计学意义(P<0.05)。单纯循环CTX+CTLs组、循环CTX+DCs疫苗组和单纯DCs+CTLs组之间比较差异均无统计学意义(P>0.05)3、循环CTX+DCs+CTLs治疗组小鼠的血清IFN-γ水平均明显高于明显高于其它各组,其差异均有统计学意义(P<0.05)。4、应用CTX的各治疗组中均未见免疫性白斑等自身免疫病及明显化疗毒副反应。结论：1、循环应用低剂量CTX通过规律调控Treg,能显著提高DCs疫苗和CTLs过继免疫治疗的疗效,为调控Tregs的基础上免疫治疗的临床应用提供了必要的理论依据。2、针对肿瘤免疫耐受的多个环节采取综合的手段才可能取得更佳的抗瘤疗效。