TDH和TRH阴性的食源性副溶血性弧菌遗传多样性和毒力研究

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副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是一种革兰氏阴性嗜盐菌,广泛存在于全球海洋、咸水湖以及海产品中,是全世界重要的食源性致病菌,在我国部分沿海地区微生物食物中毒事例中,副溶血性弧菌引发的食物中毒案例占第一位,也是许多亚洲国家海产品引发疾病的主要诱因。耐热直接溶血素(thermostable direct hemolysin,TDH)蛋白和耐热相关溶血素(TDH-related hemolysin,TRH)蛋白被认为是VP中最重要的毒力因子,临床分离株的大多数携带tdh基因,少数携带trh基因,或者同时携带两种基因,但随着研究的深入发现,一些不含TDH蛋白和TRH蛋白的菌株也有致病性,食品分离株溶血基因阳性的比例也很低,但通过食用食物引起的VP中毒事件却时有发生,因此研究TDH和TRH阴性的食源性副溶血性弧菌遗传多样性和毒力研究具有重要的意义。在本研究团队通过PCR前期筛选出不含tdh和trh的食源性VP菌株的基础上,为了了解其危害特征,本论文对该127株不含tdh和trh的VP菌株进行药敏实验和多位点序列分型(MLST)分析,在其基础上,进行全基因组测序并进行比较基因组学分析,进一步分析其遗传信息;对不含tdh和trh的部分菌株进行细胞毒理实验和动物毒理实验,对其毒力水平进行初步研究。本论文的主要内容和研究结果如下:1、127株VP菌株整体耐药性较严重,其对氨苄青霉素(AMP)的抗性最为普遍,为86.6%,其次分别为链霉素(S)69.3%、先锋霉素(KF)52.0%、头孢唑啉(KZ)40.2%、卡那霉素(K)24.5%、新诺明(SXT)15.0%;127株菌株中鉴定出51个不同的ST型,ST型最多的为ST411。其中,60株副溶血性弧菌,共计43种ST型为新型ST,VP的ST型与抗生素抗性之间未观察到明显的相关性;2、对这127株VP菌株进行全基因组测序并进行比较基因组学分析,分析结果表明,这些菌株的基因组最小为4,947,756 bp,最大为5,991,538 bp,平均大小为5,173,285 bp,最低GC含量为44.08%,最高为45.44%,平均GC含量为45.24%;泛基因组分析结果表明VP菌株的泛基因组数量达到31,243个,每株菌平均携带4,931个编码基因,其中2,769个基因为核心基因,存在于所有菌株中;直系同源基因(COG)功能分析结果显示,核心基因主要参与:能源生产和转换、氨基酸运输和代谢、翻译、核糖体结构和生物起源等功能;根据核心基因组SNP构建系统发育树,结果显示,大部分VP菌株的遗传距离比较远,说明食源性副溶血性弧菌具有丰富的遗传多样性;根据非必需基因的有无构建了聚类树,结果显示,O2血清型菌株多数聚集在一个大簇中,但大部分菌株没有聚成一簇,说明非必需基因的分布也有高的多样性,这与核心基因SNP聚类结果类似。3、通过细胞病理学和动物病理学实验,我们对不含溶血基因VP菌株的细胞毒性和肠毒性的水平进行了初步探索,其中菌株Vp353对动物模型兔子显示出了一定的肠毒性,说明不含有溶血基因的VP可能具有致病性。本研究对后续探索副溶血性弧菌潜在的新致病机制提供了良好的基础。
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