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背景与目的阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）患者的认知功能随年龄增长而进行性下降,其与tau蛋白的病理性改变呈正相关。过度磷酸化是tau蛋白最主要的病理性改变。近年来的研究发现,脑脊液或血液中tau蛋白苏氨酸181（pTau181）、苏氨酸217（p-Tau217）、苏氨酸231（p-Tau231）等位点磷酸化的升高是早期AD特别敏感的生物标记物,但磷酸化tau蛋白（phosphorylated tau,pTau）在大脑活动过程中如何产生,目前尚不清楚。长时程抑制（long-term depression,LTD）和长时程增强（long-term potentiation,LTP）是突触可塑性变化的两种主要形式,被公认为是学习与记忆的生物学基础。少量离体动物实验发现,海马LTD的诱导可以使tau蛋白丝氨酸396（p-Tau396）和丝氨酸202/苏氨酸205（p-Tau202/205）位点的磷酸化升高。海马LTD是否也能触发p-Tau181、p-Tau217和p-Tau231的表达升高?与已报道的磷酸化位点变化相比,p-Tau181、p-Tau217和p-Tau231的变化是否对海马LTD的诱导更敏感?海马LTP是否影响p-Tau的表达?目前均无研究报道。此外,离体水平神经元中的p-Tau具有较短的半衰期和较快的更新率,因而在体水平研究p-Tau的变化更贴近于临床。本课题组以往的研究表明联合注射N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR）和代谢型谷氨酸受体第5亚型（metabotropic glutamate receptor subtype 5,m Glu R5）的拮抗剂可有效阻断LTD的诱导,这两种受体的激活是否会介导LTD触发的p-Tau表达水平的变化尚不明确。有研究表明,老龄小鼠脑组织中整合应激反应（integrated stress response,ISR）水平异常升高,ISR的小分子抑制剂ISRIB（反式异构体）可以逆转ISR水平,有效恢复老龄小鼠海马神经元的衰老相关变化。本研究于在体水平对三个不同年龄段（2-3月龄、9-10月龄和17-18月龄）SD大鼠诱导海马LTD和LTP,应用免疫荧光和免疫印迹（Western blot）技术检测LTD和LTP对tau蛋白不同位点磷酸化的影响。本课题的研究结果将为以下研究提供了一种有价值的在体动物模型:（1）直接研究学习记忆相关的突触可塑性变化过程中p-Tau的产生;（2）为临床优化筛选靶向p-Tau的AD治疗方案提供良好的动物模型和实验依据。方法1.以在体电生理构建大鼠在体海马LTD和LTP模型。（1）取不同月龄（2-3月龄、9-10月龄和17-18月龄）SD大鼠,乌拉坦腹腔注射麻醉,记录海马CA3-CA1神经通路兴奋性突触后电位（excitatory postsynaptic potential,EPSP）60 min后,施加低频条件刺激（low frequency stimulation,LFS）诱导在体海马LTD,以构建不同月龄大鼠在体海马LTD模型;（2）取不同月龄（2-3月龄、9-10月龄和17-18月龄）SD大鼠,乌拉坦麻醉,记录CA3-CA1通路EPSP 60 min后,施加高频条件刺激（high frequency stimulation,HFS）诱导在体海马LTP,以构建不同月龄大鼠在体海马LTP模型。2.以免疫荧光和Western blot技术检测不同位点p-Tau的表达水平。（1）诱导LTD或LTP（见方法1）后记录30 min。通过免疫荧光技术分别检测p-Tau181、p-Tau217、p-Tau231、p-Tau202/205和p-Tau396的表达水平,以确定不同月龄大鼠海马LTD和LTP对tau蛋白上述位点磷酸化的影响;（2）诱导LTD后记录30 min。通过Western blot技术分别检测大鼠海马p-Tau181、p-Tau217、p-Tau231、p-Tau202/205和p-Tau396的表达水平,进一步确定不同月龄大鼠海马LTD对tau蛋白上述位点磷酸化的影响。3.以药理学方法进一步明确大鼠在体海马LTD触发tau蛋白磷酸化的谷氨酸受体机制。（1）取17-18月龄SD大鼠,乌拉坦麻醉,在LFS前60 min分别腹腔注射NMDAR拮抗剂CPP（10 mg/kg）或m Glu R5拮抗剂MTEP（3 mg/kg）,稳定记录CA3-CA1神经通路EPSP 60 min,施加LFS诱导LTD,继续记录EPSP 30 min,确认LTD的诱导效果。之后对大鼠进行灌注取脑以进行免疫荧光染色,分别检测p-Tau181和p-Tau217的表达水平,确定在体海马LTD触发tau蛋白磷酸化依赖的谷氨酸受体类型。4.以药理学方法明确ISRIB对在体海马LTD触发p-Tau181和p-Tau217表达升高的影响。（1）将配制好的ISRIB溶液对SD大鼠进行腹腔注射（2.5 mg/kg）,用高效液相色谱法检测ISRIB的血浆药物浓度,确定ISRIB在大鼠体内的药代动力学特征;（2）取17-18月龄SD大鼠,用ISRIB（2.5 mg/kg）连续治疗3天,每天单次腹腔注射,治疗结束后再正常笼养18天。之后进行在体电生理实验,施加LFS后持续记录30 min,确认LTD的诱导效果。对大鼠灌注取脑以进行免疫荧光染色,分别检测p-Tau181和p-Tau217的表达水平,明确ISRIB治疗后,老龄大鼠海马LTD对p-Tau181和p-Tau217表达水平的影响。结果1.LTD以年龄依赖性方式升高了大鼠海马p-Tau181和p-Tau217的表达水平。不同月龄（2-3月龄、9-10月龄和17-18月龄）SD大鼠,施加LFS均诱导出了稳定的LTD（P＜0.05）,不同年龄段的各组动物中,LTD的幅度无明显差异。电生理结束后以免疫荧光检测海马区p-Tau181、p-Tau217、p-Tau231、pTau202/205和p-Tau396的表达水平。我们发现:在2-3月龄大鼠,上述位点pTau的表达水平均无明显变化;在9-10月龄大鼠,除了海马CA1区p-Tau217的表达水平略有升高外（P＜0.05）,其它所检测位点p-Tau的表达水平均无明显变化;在17-18月龄大鼠,全海马区、CA1、CA3和DG区p-Tau181和p-Tau217的表达水平均显著升高（P＜0.05）,而p-Tau231、p-Tau202/205和p-Tau396的表达水平无明显变化。为了进一步验证上述实验结果,另取一批老龄SD大鼠,以相同条件诱导LTD后,用Western blot技术检测p-Tau的表达水平。实验结果与免疫荧光的结果一致,LTD诱导后,海马p-Tau181和p-Tau217的表达水平显著升高（P＜0.05）,不影响其他位点p-Tau的表达水平。2.阻断NMDAR或m Glu R5均可抑制LTD触发的p-Tau181和p-Tau217表达升高。以CPP和MTEP分别处理17-18月龄SD大鼠,LFS于两组大鼠均诱导出了稳定的LTD（P＜0.05）,并且两组间无明显差异。电生理结束后,取海马脑组织以免疫荧光检测p-Tau181和p-Tau217的表达水平。在CPP注射老龄大鼠组,除了海马CA1区p-Tau181略有升高外（P＜0.05）,其它区域p-Tau181和p-Tau217的表达水平均无明显变化;在MTEP注射老龄大鼠组,海马体不同区域p-Tau181和p-Tau217的表达水平均无明显变化。3.抑制ISR可阻断老龄大鼠海马LTD触发的p-Tau181和p-Tau217表达升高。在ISRIB治疗的17-18月龄SD大鼠,施加LFS可以诱导出稳定的在体海马LTD（P＜0.05）。电生理结束后取海马脑组织,以免疫荧光检测p-Tau181和p-Tau217的表达水平。我们发现:在ISRIB处理的老龄大鼠,海马LTD未能明显升高p-Tau181和p-Tau217的表达水平。4.LTP不引起p-Tau（p-Tau181、p-Tau217、p-Tau231、p-Tau202/205和pTau396）表达水平的变化。不同月龄（2-3月龄、9-10月龄和17-18月龄）SD大鼠,施加HFS均诱导出了稳定的LTP（P＜0.05）,不同年龄段的各组动物中,LTP的幅度无明显差异。免疫荧光结果显示,三个年龄段大鼠p-Tau（p-Tau181、p-Tau217、p-Tau231、pTau202/205和p-Tau396）的表达水平均未出现明显变化。结论1.LTD以年龄依赖性方式触发了大鼠海马p-Tau181和p-Tau217表达水平的升高;2.老龄大鼠中LTD触发的p-Tau181和p-Tau217表达水平升高需要NMDAR和m Glu R5的共同激活;3.抑制ISR可完全阻断LTD触发的p-Tau181和p-Tau217表达升高。