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背景和目的缺血再灌注损伤(ischemia- reperfusion injury, IRI)是在缺血的基础上恢复血流后,组织器官损伤反而加重的现象称为缺血再灌注损伤,是临床上常见的一种病理生理现象,许多缺血性疾病都可以出现缺血再灌注损伤,如：冠心病,脑梗死等的动脉搭桥术、经皮腔内血管成形术、溶栓疗法等可以使缺血的组织器官重新得到血液再灌注,产生缺血再灌注损伤。在缺血性脑血管疾病中,如何减轻这种再灌注损伤是目前研究的热点之一。生长激素(growth hormone, GH)是由垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种蛋白质激素,由191个氨基酸残基组成的非糖基化蛋白。GH不仅参与大脑的生长和发育,而且还是一种神经保护因子。研究表明GH可直接或通过胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)来发挥其生物活性,可能通过抑制细胞凋亡、促进血管的生成、减少炎症反应、体外研究GH还具有促进神经干细胞增殖和分化等。目前国内外尚缺乏GH在脑缺血再灌注损伤中对细胞凋亡、新生血管形成及Nestin表达的研究。本实验的目的是为GH的临床应用提供初步的理论依据。本研究采用TUNEL法计算海马区细胞凋亡数来探讨GH的抑制细胞凋亡作用,用免疫组织化学法观察海马区Nestin阳性细胞数和缺血周围CD34所标记的阳性新生血管数目,TTC染色显示脑缺血区,进一步探讨GH脑保护作用。材料与方法1实验动物分组及给药方法选用健康雄性SD大鼠90只,体重250～280g(由郑州大学实验动物中心提供)。随机分为假手术组(假手术+生理盐水组)、对照组(脑缺血再灌注+生理盐水组)、治疗组(脑缺血再灌注+重组人生长激素组)三组,每组30只,每组又分为7d、14d、21d三个亚组。采用改良的Longa线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。造模成功后,治疗组给予皮下注射rhGH,而对照组及假手术组皮下注射生理盐水,其注射时间、部位及剂量同治疗组。2组织切片的制备大鼠断头取脑后,在相应时间点灌注、取材,常规固定、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋,制成4μm切片,然后染色,分别进行凋亡细胞数计数、TTC法显色、Nestin和CD34免疫组化染色。3指标检测(1) TUNEL法计算海马区细胞凋亡数目。(2)应用免疫组化染色法检测海马区Nestin阳性细胞数和缺血周围CD34标记的新生血管数。(3)TTC法显示脑梗死区域,以Ulead Photo Express 2.0图像分析软件进行脑梗死轮廓勾画,法医损伤测量软件测量脑梗死面积,脑梗死面积之和乘以切片厚度即可得到脑梗死的近似体积。(4)图像分析每只大鼠连续切片,每4张抽取一张切片,选取5个不同海马及周围区域进行高倍镜(400×)观察,TUNEL法进行凋亡细胞计数,应用图象分析系统对免疫染色的阳性细胞数进行定量分析,TTC染色,测量脑梗死面积。4统计学方法所有数据以X±S表示,采用SPSS 13.0软件进行统计学处理,相同时间点不同组间比较采用方差分析,组间比较采用t检验。以α=0.05作为检验性水准。结果1 TUNEL法细胞凋亡计数变化假手术组海马区细胞凋亡数在7d、14d、21d分别为9.34±1.41,6.63±1.08,5.16±0.76,随时间变化无统计学意义(P>0.05)；对照组不同时间点神经细胞凋亡数目为70.98±1.99,61.85±1.86,46.23±2.13；治疗组为59.92±1.92,48.36±2.30,40.76±1.94。在相应时间点,治疗组均较对照组凋亡细胞数明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。2 Nestin表达的动态变化在假手术组海马区Nestin阳性细胞数有少量表达,差异无统计学意义;7d、14d、21d治疗组Nestin表达为：53.18±1.99,39.26±1.75,31.10±1.67；对照组为：35.12±1.94,29.76±1.93,27.66±1.58；治疗组在对应时间点高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。3 CD34标记的新生血管的变化假手术组缺血周围仅有少量的新生血管,差异无统计学意义(P>0.05)；对照组在7d、14d、21d分别为12.72±1.05,8.61±1.01,7.47±1.37,7d时新生血管数最多,随时间的延长而减少；不同时间点治疗组为15.43±0.69,13.52±1.37,11.65±1.08,但在相应的时间点高于对照组,差异有统计学意义,(P<0.05)。4 TTC法显示的脑组织形态学改变假手术组未见梗死灶；对照组和治疗组可见白色梗死区域,与周围有明显的界限。治疗组不同亚组的梗死体积为：37.62±0.88mm3,74.99±4.38mm3,74.24±1.72mm3；对照组为：81.84±2.27mm3,118.69±5.79mm3,128.22±1.55mm3。治疗组在对应时间点的脑梗死的体积较对照组明显缩小,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.GH对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用,可缩小脑梗死体积,其机制可能与抑制细胞凋亡有关。2.GH可增加新生血管及Nestin阳性细胞数目,促进神经功能修复。