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水稻是世界上重要的粮食作物和单子叶模式植物,研究水稻花药和花粉的发育过程及其控制机制具有十分重要的理论价值和实践意义。突变体的分离和筛选,特别是致死突变体的筛选,是研究配子体发育非常有效的途径。虽然通过这一技术路线逐步揭示了花粉和花药发育的过程与机制,但仍有大量的问题有待研究和探索。对4000份水稻T-DNA插入突变体株系(T1,T2,T3代)进行结实率及其遗传表现的观察,筛选育性突变体40份,通过表型观察及遗传分析,初步确定雌配子体败育、雄配子体败育、雌雄配子体败育突变体各1份,从中选择突变体ms40-4作进一步观察。该突变体不能结实,近乎完全不育,自交和杂交后代育性表现3∶1分离比,呈现隐性单基因位点遗传,正反交实验表明该突变体为雄配子体败育的突变体。ms40-4不育株花药开裂性差,花药裂口处细胞保持闭合状态。不育株花粉大小和形状各异,淀粉沉积程度不一,有部分空瘪花粉。DAPI染色显示不育株花粉的三核结构被破坏。切片观察显示,减数分裂前花粉母细胞(PMCs)空泡化,花药壁结构不完整;减数分裂期间PMCs不能粘附在绒毡层上,绒毡层细胞彼此分开,不形成连续的整体;成熟花药中绒毡层未能完全降解,药隔和裂口组织没有及时分解。ms40-4雄性不育突变具有多效性的特点,对其深入研究将对花药和花粉协调发育的研究提供新的线索。
阿拉伯糖(arabinose,Ara)是细胞壁重要的单糖组分之一,参与构成GAXs、RGI、AGPs和 HRGPs等多种细胞壁生物大分子。UDP-L-Ara是阿拉伯糖的活化形式,其合成受UDP-D-木糖-4-差向异构酶(UXE)控制。利用生物信息学技术和现代分子生物学方法,确认并克隆水稻UDP-D-木糖-4-差向异构酶编码基因OsUXE3。OsUXE3基因位于第8号染色体,基因组序列全长5008个碱基,包含11个外显子和10个内含子,编码一个含有406个氨基酸、分子量为44.8KD、等电点为9.11的蛋白。该蛋白包含一个大的差向异构酶(epimerase)结构域,其中含有两个高保守的特征性组件(motif)-NAD(P)+辅酶因子结合的GxxGxxG序列和上游Ser残基共同构成酶催化位点的YxxxK序列。Realtime-PCR分析表明OsUXE3基因在各个组织中均有表达,相对表达量关系为根∶茎∶叶∶减数分裂前花∶减数分裂期花∶小孢子期花∶有丝分裂期花∶成熟期花=7∶4∶2.4∶2.5∶4.4∶2.7∶5.2∶1。GUS报告基因结果显示,花粉母细胞时期,花药中有微弱的染色;从减数分裂到小孢子时期未观察到GUS信号;小孢子有丝分裂期之后GUS信号再度出现,并主要集中在花粉中;到了成熟花粉时期GUS信号达到最强,花粉中GUS信号处在细胞质中,花药壁上的GUS染色信号则位于维管束组织和花药开裂位置。激光共聚焦显微观察发现,OsUXE3-GFP与高尔基体标记N-ST-mRFP共定位,说明OsUXE3蛋白定位在高尔基体。OsUXE3 RNAi转基因T1代植株,OsUXE3下调表达对结实率和株高基本没有影响,但使叶面积明显减小、细胞壁变薄,木糖含量显著升高。OsUXE3RNAi转基因T2代植株,OsUXE3下调表达引发黑暗条件下中胚轴伸长,并与外加糖源互作,这种效应能被光照完全抑制,但对温度不敏感。
OsUXE3下调表达可能改变细胞壁结构并影响到细胞壁的机械性能,完全抑制OsUXE3的表达,有可能对水稻的抗倒伏能力和叶片的直立性带来较大影响;OsUXE3基因的研究还有助于阐明水稻中胚轴伸长的调控机制,应用于水稻直播。因此,OsUXE3基因显现出良好的应用前景。