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背景和目的 肺癌是严重危害人类生命和健康的常见病，目前国内外肺癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势。在我国城市中，肺癌的死亡率已成为恶性肿瘤之首。尽管联合应用手术、放疗、化疗、生物治疗等各种手段，肺癌患者的预后并无明显改善，原因在于肺癌的发生发展是多基因改变、多阶段的复杂过程。因此，深入研究肺癌分子生物学特征，对肺癌的早期诊断、治疗及改善预后具有重要意义。 恶性肿瘤是细胞遗传突变所致的一类分子疾病，其主要特征之一是失控性细胞增殖。近几十年来围绕细胞增殖的分子调控机制研究取得重大突破，证明癌基因活化和(或)抑癌基因失活是肿瘤发生与发展的一个重要因素。然而进一步研究发现，某些类型的癌基因和抑癌基因的主要作用是阻止细胞的正常死亡，从而揭示，肿瘤细胞内死亡调控机制失常也与肿瘤的形成密切相关。于是，细胞凋亡与癌变的关系引起人们的广泛注意，成为目前分子细胞生物学一个新的研究热点。细胞凋亡是机体重要的生理过程，起着维持内环境稳定的关键作用。凋亡调节紊乱有助于细胞的恶性转化和肿瘤的进展。是恶性肿瘤形成的重要机制之一。 凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)是抑制细胞凋亡的重要成分。Survivin是新近发现的一种IAP家族成员之一，其组织分布具有明显的细胞选择性，与另一凋亡抑制基因bcl—2的分布显著不同，在正常成人已分化的组织(胸腺、生殖腺除外)不表达，而在多种肿瘤组织中表达，且Survivin的表达与患者的预后密切相关。Survivin的表达还与细胞增殖有关。 目前关于Survivin在肺癌中表达的报道甚少，其与临床病理特征的关系尚无公认的结论。肺癌组织中Survivin基因表达与细胞增殖、凋亡关系的研究尚未见报道。为此，我们采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT—PCR)方法检测了43例肺癌组织、10例良性瘤病变和43例病灶旁正常肺组织中 Survivin mRNA的表达，采用免疫组织化学方法检测了43例肺癌组织和配对的病灶旁正常肺组织中Sur－vivin蛋白及P53人—2蛋白的表达，并探讨其与临床病理特征及P53上一2之间的关系。我们还应用流式细胞术，对肺癌细胞的增殖活性和凋亡水平进行检测分析，期望证明在肿瘤细胞系研究中得出的结论，即Survivin表达与肿瘤细胞的增殖和凋亡有关。 材料与方法 一、实验材料 标本来源于中国医科大学第一临床学院胸外科200年12月一2002年4月手术的53例患者，其中男33例，女20例，年龄15－76岁，平均年龄O5．5n．7）岁，肺癌患者43例，肺良性瘤病变10例N例炎性假瘤J例肺结核球在例肺错构瘤＊例肺平滑肌瘤人配对的病灶旁正常肺组织43例。对肺癌患者依据1997年新的修订标准进行TNM分期，其中1期27例，11期4例，皿期9例J期3例。按病理形态学分为：鳞状细胞癌16例，腺癌 23例，大细胞癌 4例。按分化程度分为：高、中分化癌 12例，低分化。未分化癌31例。所有患者均为原发性肺癌，术前均未接受过化疗或放疗等任何治疗。 二、实验方法 1．逆转录PC R检测Survivin基因表达 取50叫00mg组织，加人IInl Tizol溶液彻底匀浆。按Tizol试剂盒说明书用一步法提取总RNA，用DNA／RNA测定仪测定RNA浓度和纯度。反应体系中加人 10 x RNA PCR Biber 2叶10mM dNTP mix Zgl、25mMMgCI。4卜l、Oliso（dT）（2·somol／…）lul、RNA（二 u矿…）2“RNase inhibitor（40u／pl）0．sgl、AMV Reverse TranscriPtase（su／PI）二pl、dd H。O 7．sgl。反应条件：42℃ 30min，99℃ sndn，ST sndn。 Survivin基因引物序列为了一GGACCACCGCATCTCTACAT（上游）和 5’－GCAC＊C皿GCAGTITCC（下游）。在25 pl反应体系中含有2．srnmoVL dNP Zpl、20pmoUL上下游引物各 0．Zpl、cDNA3…、Taq DNA Polyme删e（SU／L）0．Zpl、10 x B滥r 2．spl。反应条件：94℃变性 3而n；94℃ Indn， ·2·55t＊ill，72℃ 3＊ill，35个循环；72℃延伸 7mill。用内参照 p一肌动蛋白印一actin）检测逆转录效率。PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳，漠化乙锭瞩B）显色。用 GDS 8000凝胶印 成像仪进行摄像分析。用diX174－Hincif（TaKaR公司）Markers为分子大小对照确定阳性琼脂糖凝胶电泳条带。 2．免疫组化法检狈Survivin、I？53、hcf－2蛋白表达 采用链霉菌抗生物素蛋白一过氧化酶连接uP）免疫组织化学方法，一抗 Survivin鼠抗人单克隆抗体（工作浓度为 1：30XP53鼠抗人单克隆即用型抗体人一2鼠抗人单克隆即用型抗体不P试剂盒为福州迈新公司产品。实验步骤按试剂盒说明书进行。将已知阳性胃癌切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。胞核或胞浆染为淡黄至棕黄色者为阳性细胞标志，将阳性细胞按其数量及显色强度分为3级：表达弱阳性（十人即阳性细胞数d0阮，显色强度为淡黄或仅个别细胞呈黄至棕黄色染色；表达强阳性（十人即阳性细胞数＞60阮，