柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）是革兰氏阴性的能滑动的需氧杆菌，是柱形病（columnaris disease，CD）的重要病原菌，能感染多种经济鱼类引发高死亡率，从而给水产养殖业带来巨大经济损失。该菌在水环境中广泛分布，可以引起野生鱼类、养殖鱼类甚至是玻璃缸中的观赏鱼类等发病，其菌感染引发的烂鳃病和出血病是鱼类柱形病的典型病症。病患鱼体烂鳃、鳍条腐烂脱落及体表溃疡出血等恶性症状加速了病原菌的增殖与交叉感染。很多报道己经证明使用化学药物如各种消毒剂或抗生素是治疗柱形病的一种重要手段，然而这些药物的大量使用导致了耐药性病原菌的出现，并对环境和人类产生了负面影响，存在着很大的风险性，致使疫苗免疫逐渐成为一种越来越重要的防治策略。用甲醛灭活或热灭活的柱状黄杆菌制剂防治柱形病的尝试表明通过浸泡或注射这些制剂不能为免疫鱼提供免疫保护或仅提供部分保护。而美国农业部研制的柱状黄杆菌减毒活疫苗虽然能有效的防治柱状黄杆菌的感染，但由于其疫苗包含着活菌，存在着毒力返强和与野毒株发生重组导致新毒株出现的危险。因此，为了更好的预防和控制柱形病的发生，亟须开发一种安全、高效、经济的新型柱状黄杆菌疫苗。细菌菌蜕（Bacterial Ghosts, BGs）是革兰氏阴性菌被噬菌体PhiX174的裂解蛋白E裂解后形成的完整细菌空壳，其完好的保留了与活菌一致的细菌表面的各种抗原性成分和免疫粘附分子。由于菌蜕具有优良的免疫原性、固有免疫佐剂特性以及免疫系统靶向性，能够诱导更强的体液和细胞免疫反应，因此其作为制备非活性疫苗的新策略越来越受到重视。本研究首次报道了柱状黄杆菌菌蜕的制备及其对草鱼的较强免疫保护作用。本研究以柱状黄杆菌强毒株F. columnare G4R3为研究对象，分析了其生化特性、生长特性、耐药性等生物学特性，根据已报道菌株的16S rDNA序列设计了一对特异性引物进行PCR鉴定，以我国重要的淡水鱼类经济品种草鱼（Ctenopharyngodon idellus）为实验动物测定了F. columnare G4R3的半致死浓度并检测了其对草鱼的感染致病力。F. columnare G4R3在26℃能够很好的生长，为通过升温诱导其菌蜕的产生提供了保障。F. columnare G4R3对氯霉素和头孢菌素类有较高的敏感性，而对氨苄青霉素、卡那霉素等有较低的敏感性，表明氯霉素可以作为裂解质粒的遗传筛选标记。F. columnare G4R3对草鱼腹腔注射的半致死剂量约为3.1×105CFU，应用约5倍半致死剂量对草鱼进行攻毒试验，100%的草鱼发病，80%以上的草鱼死亡，为后续草鱼的免疫和攻毒保护试验奠定了基础。菌蜕制备的核心是对裂解基因geneE的稳定抑制和可控转录表达。基于温控质粒pBV220，构建了温控裂解质粒：氨苄抗性裂解质粒pBV-geneE、源于质粒pLysS氯霉素抗性的裂解质粒pBV-geneE-cat和源于柱状黄杆菌乙酰辅酶A合成酶启动子及调控序列的氯霉素抗性裂解质粒pBV-geneE-Fpro-cat；基于IPTG诱导的pET系统，构建了IPTG诱导的融合蛋白表达的裂解质粒：卡那抗性pET28a-geneE、氨苄抗性pET32a-geneE、源于质粒pLysS氯霉素抗性的pET28a-geneE-cat与pET32a-geneE-cat。通过对F. columnare G4R3的转化均尾筛选到阳性转化子，提示菌株可能存在着某些限制外源质粒进入菌体或在菌体内稳定复制和表达的遗传屏障。对F. columnare G4R3菌株的限制性遗传屏障的研究发现：F. columnare G4R3不仅具有较强降解活性的核酸酶，还存在着一个内源性质粒（命名为FcG4P）。对质粒FcG4P的全序列解析仅发现一个与质粒复制起始相关的区域。将F.columnare G4R3通过十二烷基磺酸钠、吖啶橙及溴化乙锭非定向诱变去除质粒FcG4P，通过PCR大规模的筛选获得了去除内源性质粒的稳定衍生菌株F.columnare G4R3M。通过氯霉素抗性裂解质粒的转化试验，成功筛选到一株含温控裂解质粒的衍生菌株F. columnare G4R3M22。F. columnare G4R3M22（pBV-geneE-Fpro-cat）可通过升高培养温度至42℃来诱导裂解基因E的表达，从而形成菌蜕。在诱导裂解过程中，F. columnareG4R3M22的裂解过程比较缓慢，需要持续约10 h才能完成。F. columnareG4R3M22菌蜕（FCG）中遗传物质进行电泳分析检测不到基因组DNA的存在，表明其是比较安全的。扫描电镜和透射电镜观察显示FCG的裂解孔道主要位于菌体的两极或中间，并且菌体内不含内容物，进一步表明柱状黄杆菌菌蜕制备成功。应用FCG腹腔注射免疫健康草鱼，草鱼的血清凝集效价和血清杀菌活性显著升高，在二免后2周达到最高，随后呈下降趋势。对免疫草鱼用母源强毒株F.columnare G4R3进行攻毒，结果表明FCG能诱导草鱼产生较强的免疫反应和免疫保护，相对百分存活率达到70.9%，显著高于甲醛灭活苗组的相对百分存活率41.9%。综上所述，本研究以F. columnare G4R3为研究对象，通过分析F. columnareG4R3的生物学特性，构建了带有氯霉素抗性筛选标记的温控裂解质粒，通过分析柱状黄杆菌的限制性遗传屏障和非定性诱变筛选，获得了一株能接纳氯霉素抗性温控裂解质粒的柱状黄杆菌衍生株F. columnare G4R3M22。通过对F. columnareG4R3M22（pBV-geneE-Fpro-cat）的诱导调控，首次实现了柱状黄杆菌菌蜕的成功制备，对该菌蜕免疫效力的评价试验表明其能诱导草鱼产生较强的保护性免疫反应，有望成为一种安全、高效、经济的在临床上防治柱状黄杆菌感染的新型候选疫苗。