论文部分内容阅读
目的:研究榆干离褶伞溶栓酶(Fibrinolytic Enzyme from Lyopyllum ulamarium,LuFE)对尼古丁诱导大鼠血管内皮细胞损伤模型的保护作用及机制并探讨LuFE的体外抗血小板作用及机制。方法:(1)动物实验:32只健康SpragueDawley(SD)大鼠,体重在180～250g。随机分成对照组,模型组(尼古丁2mg/kg),LuFE低(尼古丁2mg/kg+LuFE200mg/kg)、高(尼古丁2 mg/kg+LuFE400 mg/kg)剂量组共四个组,每组8只。模型组以2 mg/kg剂量腹腔注射尼古丁诱导大鼠血管内皮细胞损伤模型。LuFE低、高剂量组腹腔注射2mg/kg尼古丁并灌胃给药200 mg/kg、400 mg/kg的LuFE。造模四周后进行相关指标检测。利用HE染色观察腹主动脉以及肺组织形态学变化:ELISA方法测定血浆TNF-α、IL-1β、ET-1、TM、vWF、PGI2、P-selectin、β-TG水平;Western blot方法观察肺组织PI3K、Akt、IκB、NF-κB蛋白的表达水平和磷酸化水平。(2)血小板体外活化实验:在体外,以胶原诱导大鼠血小板活化,并用LuFE进行干预。ELISA方法检测富血小板血浆中vWF、P-selectin、β-TG、GP-ⅡbⅢb 水平;Western blot方法观察血小板中Syk、PLCγ、P47、PI3K、Akt 以及P38蛋白的磷酸化水平。结果:(1)动物实验:腹主动脉HE染色结果显示,对照组血管内膜的结构完整、光滑,弹力纤维连续均匀,呈波浪形,无缺失断裂。经尼古丁损伤后,模型组腹主动脉血管其内膜结构的连续性被破坏,弹力纤维发生断裂和缺失。经LuFE低、高剂量干预后,血管内膜的结构逐渐恢复正常,弹力纤维连续性良好。肺组织HE染色结果显示,对照组肺泡组织结构完整,肺泡内间质无水肿,且肺泡内无微血栓形成,肺泡腔中没有炎症细胞浸润现象。经尼古丁诱导后,肺泡组织结构完整性被破坏,肺泡间隔明显增厚,肺泡腔中有炎症细胞浸润,可见微血栓形成。与模型组相比,LuFE低剂量组其肺泡间隔增厚、有少量炎症细胞浸润。LuFE高剂量组肺间质增厚减轻,无炎症细胞浸润,未见微血栓形成。ELISA检测结果表明:与对照组相比较,模型组TNF-α、IL-1β、ET-1、TM、vWF以及P-selectin水平明显上升(p<0.01),PGI2水平有所下降(p<0.01):与模型组相比,LuFE低、高剂量组 TNF-α、IL-1β、ET-1、TM、vWF 以及 P-selectin 水平明显降低(p<0.05),PGI2水平有所增高(p<0.05)。Western blot结果显示:与对照组相比,模型组肺组织PI3K、Akt、NF-κB蛋白的磷酸化水平增加,IκB蛋白表达水平明显减少;与模型组相比,LuFE低、高剂量组PI3K、Akt、NF-κB蛋白的磷酸化水平明显下降,而IκB蛋白的表达水平增多。(2)体外血小板活化实验:ELISA检测结果表明,与对照组相比,模型组vWF、P-selectin、β-TG、GP-ⅡbⅢa水平明显升高(p<0.05);与模型组相比,LuFE低、高剂量组 vWF、P-selectin、β-TG、GP-ⅡbⅢa 水平明显降低(p<0.05)。Western blot结果显示:经胶原诱导后,血小板中5yk、PLCγ、P47、PI3K、Akt和P38蛋白的磷酸化水平增加,LuFE干预后,血小板中Syk、PLCγ、P47、PI3K、Akt和P38蛋白的磷酸化水平降低,说明LuFE可抑制Syk、PLCγ、P47、PI3K、Akt和P38蛋白的磷酸化水平,同时,Akt抑制剂与LuFE联合使用时能增强对Akt蛋白磷酸化水平的抑制作用。结论:(1)LuFE对尼古丁诱导大鼠血管内皮细胞损伤具有一定的保护作用,其保护机制可能与下调PI3K/Akt信号通路有关。(2)LuFE可抑制胶原诱导的血小板的活化,其机制可能与下调Syk/PLCy/PKC信号通路以及PI3K/Akt/P38信号通路有关。