柑橘黑点病菌分子检测及其种群对嘧菌酯敏感基线的建立

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由柑橘间座壳菌(Diaporthe citri)引起的柑橘黑点病是柑橘生产中一种严重的真菌病害。近年来,柑橘黑点病发生日渐加重,果实的外观品质和销售价格下降,严重影响了柑橘产业的发展。对病原菌进行早期准确的诊断,对于柑橘黑点病的有效防控具有重要的实践意义。当前化学防治是控制该病害的主要措施,嘧菌酯是一种高效的甲氧基丙烯酸酯类(Qo I)杀菌剂,在美国被登记用于柑橘黑点病的防治,最近在我国也被登记用于柑橘疮痂病和炭疽病的防治,农药厂家也开始推荐用于黑点病的防治,及时测定用药前的黑点病菌种群对嘧菌酯的敏感基线对今后监测病菌种群抗药性的发展和科学用药具有现实意义。本文对柑橘黑点病菌的快速分子检测及其种群对嘧菌酯的敏感基线展开了研究,获得如下结果:1.柑橘黑点病菌的分子检测:利用β-微管蛋白序列,设计柑橘黑点病菌的特异性引物,基于常规PCR和SYBR Green I荧光定量PCR(Real-time PCR)建立了快速分子检测体系。在常规PCR中,该引物只能从柑橘黑点病菌D.citri的DNA中扩增获得244 bp的特异性片段,而不能从同样来源于柑橘上的14种其它间座壳属(Diaporthe spp.)真菌的DNA中扩增获得该片段。Real-time PCR中该引物对柑橘黑点病菌也只有唯一的产物吸收峰,所设计的引物具有高度的特异性。常规PCR检测灵敏度达0.78 ng/μL,Real-time PCR检测灵敏度达0.35 ng/μL。利用分子检测体系对疑似感染黑点病的叶片进行了检测,常规PCR的阳性检出率为30%,Real-time PCR的阳性检出率为60%,表明Real-time PCR比常规PCR的灵敏度更高。2.柑橘黑点病菌种群对嘧菌酯的敏感基线:分别采用菌丝生长抑制和孢子萌发抑制法测定了浙江、湖南、江西、贵州4个柑橘产区的66个柑橘黑点病菌菌株对嘧菌酯的敏感性,并建立了其种群对嘧菌酯的敏感基线。本研究所使用的66个柑橘黑点病菌菌株对嘧菌酯敏感性均较高,没有抗性菌株出现。其EC50平均值分别为(0.2285±0.1138)μg/m L和(0.0256±0.0069)μg/m L,所有柑橘黑点病菌菌株对嘧菌酯的敏感性频率分布曲线为连续的单峰型,符合正态分布。因此可将(0.2285±0.1138)μg/m L和(0.0256±0.0069)μg/m L分别作为病原菌菌丝生长和孢子萌发对嘧菌酯的敏感基线。本研究所建立的敏感基线可以用来作为监测田间柑橘黑点病菌对嘧菌酯敏感性变化的参考,对指导今后科学用药具有现实意义。
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