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背景随着人口老龄化形势日趋严峻,骨质疏松症已成为严重危害人类健康的公共卫生问题。然而,骨质疏松症发病机制复杂,涉及骨重建、骨重吸收和骨髓微环境血管形成等多个方面。目前的常用药物仅能针对单个机制,且无法有效蓄积于骨组织,不但疗效差,而且会对非骨组织或器官造成毒副作用。因此,寻找能针对骨质疏松多方面发病机制的且能特异性作用于骨组织的骨靶向药物,实现骨质疏松症的骨靶向“精准”治疗具有重要意义。Schnurri-3（SHN3）是一种锌指蛋白,在哺乳动物由Shn3基因（也被称为Hivep3基因）编码产生。以往研究发现,Shn3基因敲除的小鼠骨量明显增加,骨形成速率明显加快。抑制成骨细胞Shn3基因表达可以通过Runx2和经典Wnt信号通路促进成骨分化。此外,抑制Shn3基因表达还能降低RANKL的产生,从而抑制破骨细胞形成。另有最新研究表明:敲除成骨细胞Shn3基因后,能够促进骨形成过程中起关键作用的H型血管的形成,从而增加骨量。因此,靶向干扰Shn3基因有望成为骨质疏松的新型有效疗法。外泌体（Exosomes）是细胞分泌的生物纳米囊泡结构,直径30-100nm,在体内具有良好的长循环能力强,能够躲避网状内皮系统清除。尤其是间充质干细胞（MSCs）来源的外泌体,具有更低的免疫原性,可以作为安全的药物递送系统。然而,外泌体本身缺乏主动靶向骨组织的能力,需要对其进行工程化靶向修饰。目的基于诱导多能干细胞来源的间充质干细胞产生的外泌体,构建一种骨靶向性的工程化外泌体,靶向成骨细胞特异性递送siRNA干扰Shn3基因表达,实现促进骨形成、H型血管形成和抑制破骨细胞生成的全面抗骨质疏松疗效。方法（1）将i PSCs定向分化为MSCs,并大量扩增培养,利用流式细胞技术、三系分化实验鉴定是否被成功诱导;利用超高速离心法提取外泌体,透射电镜、NTA和蛋白免疫印迹实验鉴定i MSC-Exo。利用DSPE-PEG高效插入磷脂双分子层的特性,使成骨细胞靶向肽SDSSD插入在外泌体膜表面,得到骨靶向外泌体BT-Exo,利用免疫磁珠俘获外泌体检测靶向肽是否成功插入。通过电穿孔方法将siRNA载入BT-Exo,即形成BT-Exo-siRNA生物纳米载体系统。由粒度仪测定粒径及表面电位,通过PCR测定外泌体包裹的特定siRNA的量及释放曲线。通过RNA琼脂糖凝胶电泳评估外泌体的血清稳定性。通过第二代高通量测序技术测定载体系统与原始i MSC-Exo的mi RNA表达谱及差异。（2）用Di R染料标记外泌体,利用流式细胞术和共聚焦显微镜评价细胞对BTExo和Exo的摄取差异;将Cy5.5标记的siRNA载入外泌体,利用生物活体成像技术评价体内分布;将FAM标记的siRNA载入外泌体,OCN标记成骨细胞,通过组织切片评价体内成骨细胞能否特异性摄取靶向外泌体。（3）通过茜素红染色、ALP活性分析和免疫荧光染色评价BT-Exo-siRNA生物纳米载体系统对成骨分化的影响,通过管腔形成实验评价其对血管形成的影响,通过TRAP染色和F-actin染色评价其对破骨细胞形成的影响。（4）通过卵巢切除法构建小鼠骨质疏松模型,利用micro-CT、动态骨荧光标记实验评价BT-Exo-siRNA生物纳米载体系统对骨质疏松的治疗效果,利用组织切片H型血管免疫荧光染色和TRAP染色验证其促进H型血管形成和抑制破骨形成的作用。结果（1）成功建立了i PSCs细胞系向MSC定向分化及大量扩增的培养体系,成功提取了i MSC-Exo,平均粒径约为95nm,具有外泌体特异性蛋白标记物。成功构建了BT-Exo-siRNA骨靶向生物纳米载体系统,免疫磁珠俘获后观察到了靶向肽偶联的绿色FITC荧光和橙红色Cy3荧光。粒度仪测得BT-Exo-siRNA平均粒径约为118nm,ζ电位约为-17m V,在长达一周的时间内具有良好的稳定性。通过PCR测定外泌体包裹的siRNA的载药率约为18%,可以在24 h内大量释放。RNA琼脂糖凝胶电泳表明外泌体的具有良好的血清稳定性,可以保护内部的siRNA在16 h内不被完全降解。通过第二代高通量测序技术测定了载体系统的mi RNA表达谱,与原始i MSC-Exo无统计学差异,且其本身携带的内源性mi RNA具有促进骨形成、促进血管形成及抑制破骨分化的作用。（2）流式细胞术和共聚焦显微镜表明成骨细胞可以对BT-Exo特异性摄取,并且摄取依赖于成骨细胞表面的periostin蛋白,生物活体成像技术和组织切片表明靶向修饰可以增加外泌体在骨组织和成骨细胞的蓄积。（3）在体外机制实验中,茜素红染色和ALP定量分析表明BT-Exo-siRNA生物纳米载体系统对成骨分化具有促进作用,Image J定量分析血管形成表明其对血管形成具有促进作用,TRAP染色和F-actin染色表明其对破骨细胞形成具有抑制作用。（4）通过卵巢切除法成功构建了小鼠骨质疏松模型,micro-CT表明BT-ExosiRNA生物纳米载体系统对骨质疏松具有良好的治疗效果,动态骨荧光标记实验表明其对皮质骨形成具有促进作用,组织切片H型血管免疫荧光染色和TRAP染色证明其具有促进H型血管形成和抑制破骨形成的作用。结论本研究成功地构建了一种骨靶向工程化外泌体,能将siRNA特异性递送到成骨细胞,具有促进成骨分化、抑制破骨细胞形成和促进H型血管形成的多重功效,为骨质疏松的治疗提供了新的方略。