1 研究背景肝郁脾虚证是常见的中医证候,常见于抑郁、焦虑、胃炎、肠易激综合征等肝胆系疾病、消化系统疾病和肠道疾病,临床涉及40多个疾病病种。逍遥散是治疗肝郁脾虚证的经典方剂。目前关于肝郁脾虚证的生物学基础尚不完全清楚,因此逍遥散治疗该证候的治疗机制亦不完全清楚。慢性应激可引发焦虑症、抑郁症等多种疾病。基于慢性应激具有过程性和阶段性的特点,与肝郁脾虚证形成的病因具有高度的一致性和相关性,经相关研究证实可以用于肝郁脾虚证动物模型的造模。基于以上原因和本团队的前期工作基础,本实验采用慢性束缚应激的方法复制肝郁脾虚证大鼠模型,研究肝郁脾虚证的分子生物学基础。前期研究证实肝郁脾虚证患者体内存在多系统的功能紊乱,包括神经-内分泌系统、免疫系统、消化系统、下丘脑-垂体-肾上腺/性腺/甲状腺轴等方面。研究发现肝郁脾虚证患者和肝郁脾虚证动物模型均存在明显的摄食量异常、体重增长速度改变、便溏或是便秘、消瘦或肥胖等现象。研究表明慢性束缚应激可通过脑-肠轴影响胃的吸收功能和肠道菌群变化。Insulin/PI3K/Akt信号通路是胰岛素调节能量代谢的经典通路。PI3K/Akt的下游靶蛋白较多,涉及细胞的生长、凋亡及肿瘤代谢甚至神经信号传导等多个方面;GLUJTs是PI3K/Akt信号通路介导糖脂代谢的下游分子;SHIP2是经典PI3K/Akt信号通路的抑制剂,因此,上述物质均是参与了能量代谢尤其是糖脂代谢的调节机制。肝郁脾虚患者常伴有明显的食欲异常、消瘦或肥胖等能量代谢异常现象,因此本实验采用慢性应激的方法复制肝郁脾虚证大鼠模型,以Insulin/PI3K/Akt/GLUTs和SHIP2信号通路为切入点,探讨肝郁脾虚证能量代谢异常的生物学基础及逍遥散的治疗机制。2实验目的(1)观察肝郁脾虚证大鼠肝脏胰岛素PI3K/Akt/GLUT2信号通路相关蛋白和SHIP2蛋白的表达变化,以期探讨肝郁脾虚证能量代谢异常的分子生物学基础。(2)探索逍遥散治疗肝郁脾虚证的生物学机制,为中医肝郁脾虚证及中医临床防治慢性应激类疾病提供实验依据。3实验方法本实验主要由四部分组成。实验第一部分:通过21天慢性束缚应激法复制肝郁脾虚证大鼠模型,逍遥散作为治疗药物,以氟西汀和罗格列酮为阳性对照;分别从动物宏观表征,饮食、体重变化,旷场试验,强迫游泳实验,糖水偏好实验,胃肠动力学实验,排便情况,皮质酮水平及佐证逍遥散的治疗效果,共同证实所造模型为肝郁脾虚证动物模型。实验第二部分:采用酶免疫分析法和免疫放射法测定外周血中胰岛素和血脂四项的含量,探索能量代谢异常与糖脂代谢的关系。实验三部分:证实糖脂代谢异常的基础上,采用实时荧光定量聚合酶链反应法研究大鼠肝脏P85、Akt和SHIP2 mRNA的表达变化。实验第四部分:采用免疫印迹法和免疫组化法分别半定量和定量检测大鼠肝脏P85、Akt、GLUT2和SHIP2蛋白的表达变化;并观察逍遥散组大鼠肝脏相关物质基因和蛋白的表达水平,分析其治疗肝郁脾虚证模型能量代谢异常和逍遥散干预的分子生物学机制。4实验结果(1)实验一显示慢性束缚应激导致逐渐出现摄食量减低、体重增加速度减缓,毛发枯黄、懒怠少动、大便干湿不调等外观体征状态变化;行为学研究发现模型组大鼠在旷场实验中的穿格次数和移动总距离明显增加,糖水偏好率降低,强迫游泳时水中停浮时间明显延长,胃排空能力和小肠推进率较证明组明显下降、排便量增多或减少、便溏或是便秘等分化现象明显;血清中皮质酮含量明显升高。而逍遥散、氟西汀和罗格列酮干预后上述现象和指标明显出现不同程度的改善。(2)实验二的结果表明,模型组大鼠外周胰岛素和甘油三酯水平比正常组明显降低,高、低密度脂蛋白和胆固醇含量无统计学差异。逍遥散、氟西汀和罗格列酮对外周血中胰岛素和甘油三酯的表达水平均有调节作用,但与模型组比较并无统计学差异。(3)实验三的研究结果显示肝郁脾虚模型大鼠肝脏中P85、Akt蛋白的mRNA表达量降低,SHIP2 mRNA表达升高。与模型组相比,逍遥散干预后P85和Akt mRNA的表达量均有显著升高,但SHIP2 mRNA的表达并无统计学差异;氟西汀组SHIP2 mRNA的表达明显降低,P85和Akt mRNA表达高于模型组但低于逍遥散组;罗格列酮组P85、Akt和SHIP2 mRNA的表达均明显升高。(4)实验四研究发现与正常组比较,模型组大鼠肝脏P85蛋白含量较高、Akt和GLUT2蛋白含量明显降低,SHIP2含量较高。与模型组相比,逍遥散组P85的含量较低,Akt和GLUT2蛋白含量升高,但SHIP2蛋白含量与模型组比较并无统计学差异;氟西汀干预后SHIP2蛋白含量明显降低,GLUT2蛋白含量升高,但Akt和GLUT2蛋白含量无统计学差异;罗格列酮组大鼠肝脏中P85、Akt、GLUT2和SHIP2蛋白含量均高于模型组。5结论(1)结合对大鼠的观察、行为学实验结果及血清CORT的含量,证明本次实验应用慢性束缚应激的方法成功的复制了肝郁脾虚证大鼠模型。此外,实验发现逍遥散和氟西汀在大鼠情志异常方面均有调节作用,但氟西汀的作用功效优于逍遥散,罗格列酮在情志调节方面并未显示出显著变化;三组药物对肝郁脾虚证大鼠的摄食、体重及胃肠功能等方面均有影响价值,但罗格列酮的作用功效优于逍遥散,逍遥散的作用效果优于氟西汀。(2)模型组大鼠外周血中胰岛素和血脂中TG含量降低,说明肝郁脾虚证大鼠的食欲降低、体重增长速度缓慢、胃肠功能紊乱等情况与体内的能量代谢机制异常相关。(3)实验三和实验四的研究结果结合表明肝郁脾虚证的能量代谢异常机制与Insulin/PI3K/Akt/GLUT2信号通路的低表达和SHIP2的抑制有关;逍遥散能明显促进肝郁脾虚证模型大鼠Insulin/PI3K/Akt/GLUT2信号通路的表达,但对该信号通路的抑制因子(SHIP2)的表达并无调节作用;氟西汀可调节PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达水平,但其下游靶点因子并非GLUT2,且氟西汀对SHIP2蛋白的表达并无介导作用;罗格列酮可通过增加胰岛素和PI3K/Akt信号通路的敏感性增加Insulin/P13K/Akt/GLUT2信号通路的表达,由于该组大鼠肝脏SHIP2蛋白的表达并无显著降低,说明罗格列铜对肝郁脾虚证并无治疗效果。(4)本次研究说明逍遥对肝郁脾虚证模型大鼠的情志变化和能量代谢异常均有明显的治疗效果,氟西汀对大鼠的情志异常有显著的调节作用,但其对能量代谢的调节作用低于逍遥散,且两种药物对能量代谢的干预机制并非完全一致,罗格列酮可通过其对胰岛素及PI3K/Akt信号通路的增敏作用影响能量代谢,但肝郁脾虚证的情志低落等情况并无治疗功效。此次研究可为今后肝郁脾虚证的能量代谢机制及逍遥散的治疗机制提供依据。