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研究背景低能量激光(low level laser,LLL)是一系列波长在600-1100nm,能量密度1-10J/cm2,功率密度为3-90mW/cm2的激光。低能量激光疗法(low level laser treatment,LLLT)不仅能够促进组织修复再生,还能够增强体外培养细胞的活性。有研究表明,LLLT对于部分细胞的增殖及迁移起到显著促进作用,是细胞体外扩增的有效手段。但目前研究尚未明确LLLT用于体外细胞扩增的最适参数。此外,LLLT因其促进毛发生长的作用,已在临床已被作为改善秃发症状的辅助治疗手段。然而产生这些生物学效应的机制仍不十分明确,成为限制LLLT应用一个重要因素。本研究旨在探索LLLT促进体外培养细胞扩增的最适参数,并探索其促进毛发生长的作用机制,为LLLT在临床更精准的应用奠定理论基础。研究目的1、探求LLLT对体外培养干细胞,主要是人脂肪干细胞(Adipose derived stem cells,ADSCs)及大鼠骨髓来源间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)生物学特性的影响。2、探索LLLT对C3H/HeJ小鼠背部皮肤中毛囊的影响并探索其发生机制。研究内容1、体外培养干细胞(SCs)体外增殖能力、细胞周期及凋亡水平的检测方法:取人ADSCs及大鼠BMSCs细胞,将细胞于间充质干细胞培养基中培养。待细胞贴壁良好后,分别对两种细胞给予低、中、高剂量的LLLT照射,照射能量分别为39s,196s,392s。在LLLT照射后6h、12h、24h、48h后采用MTS法检测各组细胞活力,FACS法检测各组细胞的周期及凋亡水平。综合评价LLLT对体外培养人ADSCs及大鼠BMSCs细胞增殖能力的影响,并进一步比较剂量的高低对细胞的影响。结果:(1)LLLT对于体外培养的SCs有促进增殖的作用,该促进作用有一定的能量依赖性,即在一定范围内的LLLT能够促进SCs增殖,而超过该能量范围后LLLT对SCs的增殖并无明显促进作用;(2)LLLT对体外培养SCs的促进作用对于不同细胞效果相异,在大鼠BMSCs和人ADCSsLLLT起效时间不同:大鼠BMSCs在LLLT刺激后12h即出现增殖显著增加,24h时仍有促进作用,48h时促进作用基本消失;而人ADSCs细胞则在LLLT刺激后24h才开始出现增殖显著增加,48h时作用基本消失:;(3)较高能量的LLLT能够增加SCs细胞(大鼠BMSCs、人ADSCs)的细胞凋亡水平。2、体外培养人ADSCs及大鼠BMSCs细胞迁移能力的检测方法:取人ADSCs及大鼠BMSCs细胞生长达80%-90%融合后用于实验,行划痕实验,观察并分析迁移能力。结果:(1)低剂量的LLLT能够使人ADSCs细胞的迁移能力增强,中、高剂量的LLLT并不会削弱ADSCs的迁移能力。(2)低剂量的LLLT对大鼠BMSCs细胞的迁移能力无影响,中、高剂量的LLLT减弱大鼠BMSCs细胞的迁移能力。3、LLLT照射对C3H/HeJ小鼠背部毛囊的作用及其机制初探方法:取雌性C3H/HeJ小鼠,随机分为两组:激光照射组(LLLT组),对照组(CNTL组),所有小鼠均行背部脱毛处理。腹腔注射EdU溶液后,即刻给予LLLT照射。LLLT照射后4h,1d,2d,5d,7d,10d,15d,20d,进行取材行组织学染色、rt-PCR及western blot检测后对结果进行统计学分析。结果:LLLT能够诱导C3H/HeJ小鼠背部皮肤中处于休止期的毛囊进入生长期,该作用可能是通过激活Wnt1Ob介导的Wnt1Ob/β-catenin信号转导通路实现。结论1、较低能量的LLLT能够通过诱导G0/G1期细胞进入DNA复制阶段,对这两种细胞起到促进增殖的作用,并且无诱导细胞凋亡的作用;高能量的LLLT不仅对该两种细胞的增殖无正性作用,反而会增加细胞的凋亡水平。2、从细胞迁移能力方面观察,LLLT对于BMSCs作用:在剂量较高时,LLLT会抑制BMSCs的迁移能力,而低剂量无明显影响。对于ADSCs作用:低剂量的LLLT能够使细胞的迁移能力增强,并且过高剂量的LLLT不会削弱ADSCs的迁移能力。3、LLLT能够促进小鼠背部毛发的生长,其作用机制可能为促进了毛囊由休止期向生长期转换,同时促进了毛囊细胞的增殖,该促进作用可能与Wnt1Ob/β-catenin信号转导通路密切相关,通过上调Wnt1Ob、β-catenin、LEF1等Wnt10b/β-catenin信号通路关键蛋白水平而实现。