目的绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)是重要的人畜共患病原菌。绿脓杆菌感染可发生在人体任何部位和组织,引起心内膜炎、胃肠炎、脓胸甚至败血症;在幼小畜禽中往往大群暴发,常与大肠杆菌混合感染,或者是出壳雏鸡接种马立克氏病疫苗造成绿脓杆菌严重感染,1～2天内死亡达70%～80%。绿脓杆菌能产生多种与毒力有关的物质,其中绿脓杆菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,PEA)是一种致死性外毒素,是绿脓杆菌最主要的致病因子。人们已经对PEA的结构与作用机制有一定的研究,在此基础上,人们利用基因工程技术将它改造为具有医疗用途的蛋白质:利用PEA的细胞毒性作用制成免疫毒素,作为治疗癌症的药物;利用PEA很好的免疫原性制备防治绿脓杆菌感染的基因工程疫苗或将PEA作为蛋白疫苗佐剂和疫苗载体,可以大大提高免疫原性;利用PEA能够携带蛋白质或DNA进入细胞中的特殊功能,将其应用于基因治疗。PEA的上述重要的临床应用一直刺激着对PEA的分子结构和功能的研究。然而绿脓杆菌菌株多,毒力差异大,GeneBank已发表的全长PEA序列只有三个(K01397,strain PA103;AE004091,strain PA01;CP000438,strain UCBPP-PA14),Blast分析结果显示它们的PEA碱基序列与氨基酸序列均存在着差异。研究不同菌株间PEA结构和PEA蛋白生物活性的差异可以揭示PEA结构与细胞毒性及免疫原性的关系,从而使PEA更好的应用于免疫毒素、疫苗方面和基因治疗。因此本实验拟克隆绿脓杆菌产毒株ATCC27853的PEA全长编码基因序列,以提供素材用于PEA结构的比较研究。本实验也对克隆的PEA基因进行了序列分析,并构建其真核表达载体pcDNA3.1A/PEA,将其转染人肾胚胎上皮细胞-HEK293T细胞,实现了PEA基因在真核细胞中的分泌性表达,以便今后进一步研究PEA结构与细胞毒性和免疫原性的关系,从而为PEA的细胞毒性和免疫原性在免疫毒素、疫苗和基因治疗方面的应用奠定基础。方法本研究根据GeneBank已发表的绿脓杆菌标准毒株PA103序列设计1对特异性引物,从绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC27853菌株中提取细菌基因组DNA,以此为模板,用PCR方法扩增绿脓杆菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosaexotoxin A,PEA)全长编码基因,利用pMD18-T载体构建PEA的克隆载体pMD18-T/PEA,经过蓝白斑筛选,限制性内切酶HindⅢ和XbaⅠ双酶切鉴定和PEA基因内部的KpnⅠ单酶切鉴定后,进行PEA基因序列测定。将测序结果与GeneBank已发表的PA103菌株的序列进行比对,确定克隆的基因确是绿脓杆菌ATCC27853菌株PEA全长编码基因后,将PEA亚克隆入pcDNA3.1A真核表达载体,用克隆位点的HindⅢ和XbaⅠ以及PEA基因内部的ApaⅠ对重组质粒pcDNA3.1A/PEA进行酶切鉴定。为鉴定带有原信号肽(原核生物信号肽)的PEA基因能否在真核细胞中表达,本研究用真核表达载体pcDNA3.1A/PEA转染人肾胚胎上皮细胞-HEK 293T细胞,同时用pcDNA3.1A空载体转染HEK 293T细胞作为阴性对照。通过多次试验建立了磷酸钙方法瞬时转染HEK293T细胞的真核细胞表达系统。用Western blot方法检测PEA的表达。结果以基因组DNA为模板,利用PCR方法扩增PEA基因后,经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,得到1条符合预期片段大小的特异性片段,即1914 bp。将PCR产物连接到pMD18-T载体上,经酶切鉴定正确后,把重组质粒pMD18-T/PEA送公司测序。将测序结果与GeneBank已发表的PA103菌株的序列进行比对,确定本实验克隆的基因确是绿脓杆菌ATCC27853菌株PEA全长编码基因。将PEA基因亚克隆入pcDNA3.1A真核表达载体,酶切重组质粒进行鉴定,电泳结果符合预期片段大小。结果证明pcDNA3.1A/PEA真核表达载体构建成功。将重组质粒pcDNA3.1A/PEA转染真核细胞HEK293T细胞,Western blot检测结果显示在分子量约为130 KDa处有一条明显的杂交带,而空载体在相应位置未见杂交带。结论从绿脓杆菌ATCC27853菌株基因组DNA中扩增出PEA全长编码基因;序列分析发现绿脓杆菌ATCC27853菌株与标准毒株PA103的基因序列和氨基酸序列均存在着差异,同源性均达99%;成功构建了PEA基因的真核表达载体pcDNA3.1A/PEA,并将其转染真核细胞,实现了它在真核细胞中的分泌性表达,以便今后进一步研究PEA结构与细胞毒性和免疫原性的关系,从而为PEA的细胞毒性和免疫原性在免疫毒素、疫苗和基因治疗方面的应用奠定基础。