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本研究用固定化酶技术将果胶酶制成固定化小球,以铜绿微囊藻(Microcysticaeruginosa)为作用对象,研究了固定化小球的酶学特性及其抑制藻细胞群体、个体、亚显微结构和生理生化特征的时相变化;用糖组学的观点和方法,探索了固定化果胶酶抑制蓝藻的分子基础和作用机理。
研究结果表明:固定化果胶酶小球的Km值为0.45,对底物的亲和力显著大于Km值为3.9的游离酶。最适pH4.0,温度40℃,耐高温和酸碱。反复使用5次后(对铜绿微囊藻作用每次24h)仍然保留55%酶活,酶学性质比游离酶更稳定。固定化果胶酶小球抑制藻细胞群体,在有光照和无光照条件下的宏观表像截然不同。在光照条件下,细胞群体第3天就明显黄化,黄化程度与固定化小球的用量和作用时间成正相关系;在无光照条件下,细胞群体2个月都未出现明显黄化,与固定化小球的用量和作用时间无相关关系。在光照条件下,轻微损伤的藻细胞出现质壁分离,光合片层结构被破坏,类囊体结构模糊,散乱分布于细胞质内,核区被挤至细胞一侧,拟核消失,细胞内大部分出现中空,细胞质浓缩沉淀,细胞萎缩,丧失球形结构。严重损伤的藻细胞和衰亡细胞,球形结构完全解体,呈匀质状物质,类囊体完全断裂,形成颗粒状结构,胞质流出,形成不规则的细胞残片。藻细胞计数、叶绿素a含量和MDA测定结果也证明光照条件下固定化小球能够有效抑制铜绿微囊藻细胞的生长;在无光照条件下叶绿素a含量没有明显降低,与细胞群体无黄化表象的观察结果一致,说明藻细胞计数和MDA含量是细胞衰亡的特征数据。叶绿素a含量受光照影响明显,不能直接作为细胞衰亡的特征数据,同时也表明微囊藻细胞叶绿素a的分解必须有光参与。
不连续SDS凝胶电泳、银染与糖蛋白专性染色结果发现:经固定化小球处理的藻细胞与对照相比,胞内ADa蛋白表达量明显减少或消失。经MALDI-TOF-TOF质谱鉴定,该蛋白与绿藻(Mesostigmavirideactin)肌动蛋白(actin)为同源蛋白,可能性得分为55,大于25,肽段覆盖率(coverage)为11%,表明ADa蛋白与绿藻actin具有较高的同源性。根据actin是支撑细胞结构的功能蛋白,ADa蛋白是导致酶处理藻细胞丧失球形结构的分子基础。
利用TLC检测果胶酶处理铜绿微囊藻细胞后的糖代谢产物,检测到一种与胺或蛋白相连的糖类物质,该物质伴随藻细胞的黄化而产生,可能与藻细胞衰亡有关,值得深入研究。