缝隙连接蛋白的缺陷能引起缝隙连接通道功能障碍,从而导致多种严重疾病。所有缝隙连接蛋白中,缝隙连接蛋白26(Connexin26,Cx26)最为著名,发病率也最高。在几乎所有人种中,都发现了 Cx26缺陷相关的非综合征性或综合征性耳聋。Cx26缺陷常常会严重影响耳蜗功能导致耳聋。Cx26由GJB2基因编码,东亚人最高发的缺陷类型是235delC,其携带率约为1%。目前Cx26缺陷的致聋机制还未完全阐明,动物和人的研究存在差异,如在小鼠模型的研究中,完全敲除Cx26表达会阻碍跨胎盘的葡萄糖摄取,导致胚胎死亡。而人Cx26缺陷一般不会引起人胚胎的致死性事件,原因是人体胎盘屏障的结构与小鼠有很大的不同,Cx26缺陷不会影响人胚胎跨胎盘的葡萄糖摄取。但在听觉发育中,Cx26功能的重要性显然强于在胎盘中,Cx26缺陷常常造成听觉发育的异常,最终导致耳聋。2006 年 Takahashi 和 Yamanaka 发现通过调控体细胞的 Oct4,Sox2,Klf4,c-myc 这 4个基因可以将体细胞转化为诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)。中国学者随后证明了该细胞的全能性。iPSC像胚胎干细胞等其他多能干细胞一样,经过生长因子和细胞传代条件的调节,可以分化成神经元和胶质细胞。iPSC分化出的神经元细胞带有特定病人的基因信息,即带有特定的基因突变或神经疾病。在这样的条件下,我们能通过研究人的iPSC来研究特定人体的活体神经组织。近年的研究发现了数个可作为iPSC来源的简易途径,包括皮肤成纤维细胞、外周血细胞、角质形成细胞。iPSC技术的发明为人体疾病模型的建立、疾病细胞的研究和治疗提供了广阔的前景。本论文开展了如下三个方面的研究:1.采用非整合Episomal质粒诱导方式,重编程Cx26缺陷耳聋患者的体细胞,建立疾病特异的iPSC细胞系的初步研究。结果显示:患者的耳后皮肤组织切块,并原代培养后,于第7天,人皮肤组织周围可以观察到大量类成纤维细胞增生。将成纤维细胞扩增后,以非整合Episomal质粒电转染,电转染第7天能明显观察到细胞的形态由原先的梭形慢慢变圆,电转染患者成纤维细胞2周后,可以观察到一些形态类似于hESC的单克隆群落。所有患者来源细胞的培养中都可以收集到碱性磷酸酶阳性的类hESC单克隆群落。PCR排除了载体自身基因oriP/EBNA1整合入这些克隆的可能。传代数次后,分别得到了所有3个患者特异的iPSC系,依序分别命名为iPSC-1、iPSC-2、iPSC-3。DNA测序确认了这3个细胞系中Cx26 GJB2 235delC突变。免疫荧光确认了这3个细胞系都表达人胚胎多能性干细胞核蛋白OCT4 and膜蛋白SSEA4,而未检测到小鼠多能性干细胞特异性膜蛋白SSEA-1的表达。RT-PCR显示内源性OCT4,SOX2,NANOG,DPPA3的表达和H9 hESC基本一致。核型分析显示这些细胞系有正常的46条染色体。所有这些数据显示这些Cx26缺陷的iPSC系来源于人皮肤成纤维细胞,同时拥有多能干细胞的特征。2.评价Cx26缺陷iPSC细胞系向各胚层分化的体内、体外研究。为了评价Cx26缺陷iPSC细胞系的体外分化能力,将iPSC-1、iPSC-2、iPSC-3继续培养7天后分化为拟胚体(embryoid bodies,EBs)。实时PCR显示EBs表达所有三个胚层的关键标记物,包括外胚层的microtubule-associated protein 2(MAP2),paired box 6(PAX6),中胚层的Msh homeobox1(MSX1)和内胚层的 SRY-box containing gene 17(SOX17)(Fig.S2B)。为了评价体内分化能力,将iPSC-1、iPSC-2、iPSC-3各1X106细胞分别注入严重联合免疫缺陷鼠(severe combined immune deficiency,SCID)。4周后,可以从皮下得到各个细胞系形成的畸胎瘤。HE(hematoxylin-eosin)染色后,光镜下可以见到三胚层组织,包括内胚层的腺体结构、中胚层的软骨和外胚层的上皮、神经纤维。这些结果显示这三个系具有多能干细胞的体内体外分化能力。3.Cx26缺陷iPSC细胞系向神经细胞分化、建立疾病细胞模型、及其基因表达差异的研究。去除饲养细胞和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)后,3个iPSC系很快分化为EB。7天后EB进一步分化出神经上皮(neuroepithelial,NE),12-18天可以发现典型的神经管状花结。NE中高度表达PAX6和N-CADHERIN,并且在神经管形成后进一步上调,同时多能性基因NANOG在分化为神经前体细胞(neural progenitor cells,NPCs)后显著下调。在神经分化过程中,具有典型柱状上皮形态的神经上皮细胞逐渐出现,第10天,免疫荧光可以染出强阳性的神经外胚层转录因子PAX6和NESTIN。神经球培养数天,可观察到突触样结构形成,向神经元分化。第20天,可以观察到NEUN、class Ⅲ β-tubulin(TUBB3)染色弱阳性的神经前体细胞。第42天,可观察到一些形态类似星形胶质细胞、高表达GFAP的细胞团。同期在其他细胞中可以观察到典型的神经元突触样结构,TUBB3染色强阳性。所有Cx26缺陷iPSC来源的神经细胞,和作为对照的hESC来源神经细胞没有观察到形态上的区别。以上结果显示,所有3个Cx26缺陷iPSC能够和hESC一样在体外分化为相似的神经前体细胞和神经元细胞,形态、内源性、外源性基因表达都非常一致。iPSC和hESC来源的神经元细胞中,Q-PCR检测缝隙连接蛋白基因GJB1(Cx32)、GJB2(Cx26)、GJD2(Cx36)表达水平,结果显示,所有iPSC来源神经元细胞与hESC来源神经元细胞比较,Cx26(GJB2)变化不显著,Cx32(GJB1)表达明显上调,Cx36(GJD2)表达略微上调。结论:能够成功通过非整合Episomal载体转染建立Cx26缺陷聋的iPSC细胞系,Cx26缺陷不影响细胞系的神经分化,在Cx26缺陷聋的神经细胞模型中,Cx32可能发挥代偿作用。