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Rac/ROP(Rho-related GTPase from plants)是植物特有的参与信号转导的小G蛋白家族,它作为分子开关在植物的生长发育过程中发挥着各种各样的调控作用,例如调控花粉管伸长、调控根毛的发育、调节H202的产生、参与植物激素如生长素和ABA的信号转导等.GTP酶激活蛋白RopGAP(RopGTPase activatingprotein)是ROP的负调控因子.在RopGAP存在时,ROP蛋白内在的GTP酶活性得以提高,使得GTP结合的Rac/Rop水解转化为非活性的GDP结合态.在模式植物拟南芥中,RopGAP家族共有6个成员,通过对RopGAP家族中的氨基酸序列比对分析发现其由一些固有的保守结构域组成,中心区域是一个GAP-like区域,所有的RopGAPs都含有一个CRIB(Cdc42/Rac-interactive binding)结构域,而动物和真菌的GAPs缺少这个结构域.CRIB与GAP通过一段保守的序列连接起来,但是RopGAPs不同成员间的C端和N端却是各不相同的.
本论文运用反向遗传学的方法对拟南芥Rac/RopGAP2基因的功能进行了初步分析,主要结果如下：
1、植物表达载体的构建与转基因植株获得.我们分别构建了GAP2p::GUS、358::GAP2和GAP2RNAi载体,并成功地获得大量转基因植株.
2、GAP2基因表达模式分析.对于GAP2p::GUS转基因植株,我们分别取不同的组织做了GUS组织化学染色,分析了GAP2基因在植物胚胎发育和胚后发育阶段的时空表达模式.观察发现GAP2在胚胎发育的球型胚、心型胚、鱼雷型胚和成熟胚时期均有表达且遍布于整个胚,结果显示RopGAP2在胚胎发育时期是组成型表达的.
幼苗的GUS染色显示,GAP2基因在幼苗的茎顶端生长点、根部的分生区和侧根原基处等细胞分裂旺盛的部位有较高水平的表达.在幼苗子叶中,GAP2在气孔拟分生组织处表达,我们还观察到一种有趣的现象,GAP2在气孔保卫细胞上表达强弱呈极性分布,即靠近气孔一侧表达水平明显比其他位置高.对花的GUS染色观察发现,GAP2在花瓣维管组织、花柱和子房等处表达.
3、GAP2RNAi和GAP2过表达植株的表型分析.对T1代GAP2RNAi植物进行表型分析时,我们观察发现转基因植株子叶气孔发育呈现不同程度的缺陷,如气孔的分布和间隔发生异常,经常观察到多个气孔聚集在一起,这个结果表明GAP2基因对于气孔模式的建立可能具有重要的调控作用。过表达35S::GAP2植株的表型分析正在进行当中。
4、YFP标记的GAP2融合蛋白亚细胞定位分析。我们对GAP2蛋白的亚细胞定位进行了初步观察。在拟南芥原生质体细胞中表达35S::YFP::GAP2,观察到YFP::GAP2融合蛋白主要定位于细胞膜和细胞膜周边区域,这暗示着GAP2在质膜区域定位对于其执行生化功能非常重要。