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活性氧(ROS)在植物生长发育和对各种逆境适应过程中扮演双面角色:高浓度下引起氧化损伤、低浓度下起着第二信使作用,其角色转换取决于其产生和清除之间的平衡状态,并严格受控于体内一套由酶和非酶组分构成的双元抗氧化系统。在抗氧化酶类中,位居细胞质的抗坏血酸过氧化物酶1(APX1)在胞内氧化还原态水平调控中起到关键作用,在ROS清除网络中居于核心地位,已被视作ROS功能的重要杠杆,并因而获得相对最广泛的研究关注。但是,APX1热不稳定,可能是植物热敏感的主因之一,因而推测提高该酶蛋白的热稳定性将有助于提高植物的耐热性。目前,用于构建热稳定蛋白变体的分子生物学手段主要有两种:一种是对特定靶蛋白进行定点或随机突变;另一种是对感兴趣的蛋白融合热稳定功效接头。由于简单、通用、无需预知蛋白高级结构信息等特性,融合策略已逐渐受到越来越多的关注。本工作以小桐子和拟南芥APX1为研究对象,选取一系列超酸性融合接头,通过构建其与APX1的融合蛋白,探讨其在提高APX1蛋白热稳定性和酶活性方面的作用。主要结果如下:(1)小桐子和拟南芥APX1的基因克隆及融合表达载体的构建使用Trizol法分别提取小桐子和拟南芥幼苗的总RNA,并反转录成cDNA作为PCR模板。通过设计基因特异性引物,扩增得到全长编码区序列JcAPX1、AtAPX1,并克隆到大肠杆菌载体pET32a(+)中,构建了其原核表达载体pET(Jc APX1)和pET(AtAPX1),并通过测序验证。然后,将超酸性接头(ATS、ATTa、ATTb、Mb、ATYd)的DNA片段于同一读码框内插入到载体pET(JcAPX1)或pET(AtAPX1)中APX1基因编码区的3’端,构建了一系列JcAPX1或AtAPX1的大肠杆菌融合表达载体。(2)超酸性融合接头能够显著提高JcAPX1和AtAPX1的热稳定性并保护其免遭热失活由基于SDS-PAGE的热稳定性分析结果看出,所用超酸性接头(ATS、ATTa、ATTb、Mb、ATYd)都能显著增强重组JcAPX1融合蛋白的可溶性或热稳定性。同时,APX非变性PAGE胶活性染色和酶活分光光度测定法结果表明,这些超酸性接头还能有效保护JcAPX1免遭热失活,使JcAPX1的耐热性至少提高了2℃。另外,通过同样分析发现,接头ATS、ATTa也能显著提高AtAPX1的热稳定性和高温酶活性,使其耐热性至少提高了3℃。这些超酸性融合接头在大肠杆菌中对APX1重组蛋白的热稳定作用应能在植物中重现,本工作创建的APX1热稳定变体可以用来缓解高温胁迫导致的氧化损伤,为提高植物耐热性提供了一条潜在的有效途径。因此,不难看出,本工作为以后进一步通过APX1转基因手段提高植物的耐热性已打下必要的前期基础。