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目的:使用原代培养的大鼠骨骼肌细胞作为研究对象,用棕榈酸处理并给予亮氨酸干预,观察亮氨酸干预对棕榈酸处理的骨骼肌细胞线粒体功能的影响及其机制,为2型糖尿病的防治提供新的依据。方法:培养大鼠原代骨骼肌细胞,CCK-8法测定不同浓度棕榈酸(0,0.2,0.25,0.4,0.5,0.6,0.75 mmol/L)处理和亮氨酸(0,0.25,0.5,1.0,2.0 mmol/L)干预,以及不同作用方式(棕榈酸处理24 h后亮氨酸干预24 h,棕榈酸和亮氨酸联合处理24 h,棕榈酸和亮氨酸联合处理48 h)时骨骼肌细胞的活性。Western Blot测定不同浓度亮氨酸干预时骨骼肌细胞胰岛素信号通路磷酸化蛋白激酶B Ser 473位点(PhosphoSer 473-protein kinase B,pSer 473 AKT)的表达水平,确定棕榈酸和亮氨酸干预剂量及干预方式。将原代培养的大鼠骨骼肌细胞分为对照组(Control,Con组),0.25 mmol/L亮氨酸干预组(Leucine,Leu组),0.25 mmol/L棕榈酸干预组(Palmitate,PA组)和0.25 mmol/L棕榈酸处理+0.25 mmol/L亮氨酸干预组(Palmitate+Leucine,PL组),干预时间为24 h。Western Blot测定骨骼肌细胞pSer 473 AKT、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)和支链氨基酸代谢关键酶:线粒体支链氨基酸转移酶(Mitochondrial branched chain amino aminotransferase,BCATm)、支链α-酮酸脱氢酶(Branched-chain a-keto acid dehydrogenase,BCKDH)和支链α酮酸脱氢酶激酶(Branched-chainα-ketoacid dehydrogenase kinase,BCKDK)的蛋白表达水平。实时荧光定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)检测骨骼肌线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)和线粒体生成相关基因过氧化物酶体增殖物受体共激活因子1α(peroxisome proliferators-activated receptorγcoactivator-1α,PGC-1α)、核呼吸因子(Nuclear respiratory factor 1,NRF-1)、线粒体转录因子A(Mitochondrial transcription factor A,TFAM)和去乙酰化蛋白1(sirtuin1,SIRT-1)的mRNA表达水平。激光共聚焦显微镜观察骨骼肌细胞线粒体数量和线粒体活性氧族(Reactive oxygen species,ROS)。比色法检测骨骼肌细胞三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)含量。结果:1.干预剂量及方式的确定:棕榈酸作用24 h且浓度高于0.4 mmol/L时,骨骼肌细胞存活率显著降低。不同剂量亮氨酸对骨骼肌细胞活性无显著性影响,0.25 mmol/L亮氨酸即可显著增强胰岛素刺激状态下pSer 473 AKT表达。骨骼肌细胞存活率在0.25 mmol/L棕榈酸处理24 h+0.25 mmol/L亮氨酸干预24 h时发生显著降低,在0.4 mmol/L棕榈酸、0.25 mmol/L亮氨酸联合处理24 h及48 h时骨骼肌细胞存活率均发生显著性降低。因此,本研究的干预剂量及方式确定为0.25 mmol/L棕榈酸和0.25 mmol/L亮氨酸联合处理24 h。2.骨骼肌细胞胰岛素敏感性:胰岛素刺激状态下,PA组与Con组相比,骨骼肌细胞p-AKT蛋白表达水平显著降低;PL组与PA组相比,骨骼肌细胞p-AKT蛋白表达水平显著增加,mTOR表达水平无显著性差异。3.BCAA分解代谢关键酶的蛋白表达水平:PL组与PA组相比,骨骼肌细胞BCATm表达水平显著增加,BCKDH的蛋白表达水平无明显改变,但调节BCKDH活性的激酶BCKDK的表达水平显著降低,提示亮氨酸干预可增加骨骼肌细胞BCAA的分解代谢。4.骨骼肌细胞线粒体生成相关基因的表达:PL组与PA组相比,骨骼肌细胞线粒体生成基因PGC-1α、TFAM的表达显著增加,SIRT-1的表达显著降低;PA与Con组相比,骨骼肌细胞线粒体数量显著减少;PL组与PA组相比,骨骼肌细胞线粒体数量显著增加,mtDNA的含量无明显改变。5.骨骼肌线粒体功能相关指标:PA与Con组相比,骨骼肌细胞线粒体ROS显著增加;PL组与PA组相比,骨骼肌细胞线粒体ATP合成显著增加,线粒体ROS显著减少。结论:本研究的实验条件下,0.25 mmol/L的亮氨酸干预可显著改善棕榈酸处理的原代培养骨骼肌细胞的胰岛素敏感性,促进BCAA分解代谢。亮氨酸干预的这一作用可能是通过促进骨骼肌细胞的线粒体生成,降低线粒体氧化应激损伤,改善线粒体功能来实现的。