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研究目的:1.明确PIWIL1在多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)原代细胞及MM细胞系中的表达情况;2.研究PIWIL1在MM细胞系生长及耐药中的作用;3.探索PIWIL1是否通过自噬介导MM进展和耐药及其调节的自噬通路方法:1.临床资料磁珠分选12例初治多发性骨髓瘤患者骨髓样本及4例健康志愿者骨髓样本中CD138+细胞,利用q RT-PCR、Western Blot检测CD138+细胞中PIWIL1m RNA和PIWIL1蛋白的表达水平。2.体外实验(1)利用q RT-PCR、Western Blot检测MM细胞系RPMI8226、NCL-H929、U266、ARH-77中PIWIL1m RNA和PIWIL1蛋白的表达水平。(2)利用PIWIL1c DNA慢病毒和空载病毒转染NCL-H929细胞,上调NCL-H929细胞中PIWIL1的表达水平,实验组和对照组分别标记为:PIWIL1+929,PIWIL1+929 NC;同样利用PIWIL1c DNA慢病毒和空载病毒转染RPMI8226细胞,上调RPMI8226细胞中PIWIL1的表达水平,实验组和对照组分别标记为:PIWIL1+8226,PIWIL1+8226NC;利用PIWIL1 RNAi慢病毒和空载病毒转染NCL-H929细胞,下调NCL-H929细胞中PIWIL1的表达水平,实验组和对照组分别标记为:PIWIL1—929,PIWIL1—929NC。1)利用q RT-PCR和Western Blot分别检测各组细胞中PIWIL1 m RNA及蛋白的表达,确定转染效率;2)采用CCK-8检测各组细胞增殖的差异,以及对化疗药物地塞米松(Dexamethasone,Dex)、硼替佐米(Bortezomib)、阿霉素(Doxorubicin)敏感性的差异;3)采用流式细胞术检测各组细胞凋亡的差异;4)采用Western Blot检测各组细胞BCL-2,Caspase-3等凋亡蛋白的表达变化;5)通过透射电镜观察MM细胞自噬小体的形态特点和数目;6)采用Western Blot检测各组细胞m TOR,p-m TOR,P62,LC3A/B,Parkin,TBK-1,p-TBK-1,OPTN等自噬蛋白,以及p AKT的表达水平;7)采用CCK-8检测线粒体自噬抑制剂环孢素A(Cs A)处理前后各组细胞对化疗药物地塞米松敏感性的差异。3.体内实验NOD/SCID小鼠建立多发性骨髓瘤皮下移植瘤模型,分别皮下注入PIWIL1+929、PIWIL1+929 NC;PIWIL1—929、PIWIL1—929NC细胞,比较各组肿瘤的体积并记录各组成瘤时间。通过免疫组织化学方法检测瘤体内P62、p-m TOR、OPTN、BCL-2等蛋白的表达情况。研究结果:1.初治骨髓瘤患者CD138+细胞及骨髓瘤细胞系中PIWIL1表达水平均高于正常对照组;2.CCK-8结果显示,上调PIWIL1表达可提高MM细胞增殖能力,下调PIWIL1表达可抑制MM细胞增殖能力;上调PIWIL1表达后MM细胞对化疗药物地塞米松、硼替佐米、阿霉素的敏感性降低,下调PIWIL1表达后提高了MM细胞对以上化疗药物的敏感性。3.流式细胞术结果显示,上调或下调PIWIL1表达对MM细胞的凋亡无明显影响。4.透射电镜下观察到上调PIWIL1后MM细胞内自噬小体数目明显增加,且可明显看到线粒体自噬。5.Western Blot结果显示上调PIWIL1后,LC3A/B-II,Parkin、p-TBK-1,OPTN、p-AKT等蛋白表达水平明显升高,m TOR,p-m TOR,P62表达水平显著下降;下调PIWIL1后p-AKT的表达水平明显升高,以上蛋白表达水平呈现相反变化趋势。上调或下调PIWIL1后凋亡蛋白BCL-2,Caspase-3的表达水平无明显差异。6.CCK-8结果显示,Cs A预处理各组转染细胞,与阴性对照相比上调或下调PIWIL1后MM细胞对地塞米松的敏感性无显著差异;7.上调PIWIL1可以显著促进NOD/SCID鼠皮下种植瘤的生长,下调PIWIL1可以抑制NOD/SCID鼠皮下种植瘤的生长。瘤体免疫组化结果显示,上调PIWIL1后自噬蛋白P62,p-m TOR表达水平下降,OPTN表达增加,下调PIWIL1表达后,上述蛋白的表达水平呈现相反变化趋势;上调或下调PIWIL1后凋亡蛋白BCL-2的表达水平无明显差异。结论:1.PIWIL1在多发性骨髓瘤原代细胞及多发性骨髓瘤细胞系中高表达2.PIWIL1可在体内外促进多发性骨髓瘤疾病进展3.PIWIL1可通过自噬促进多发性骨髓瘤疾病的进展及对地塞米松耐药,且线粒体自噬可能是PIWIL1介导MM细胞对地塞米松耐药的机制之一