论文部分内容阅读
咖啡是世界三大饮料（咖啡、茶、可可）之一。然而,由专性寄生真菌咖啡（驼孢）锈菌（Hemileia vastatrix Berk.and Broome）引起的咖啡叶锈病（Coffee leafrust,CLR）是小粒种咖啡最具毁灭性的世界性病害,对咖啡生产造成严重的经济损失。深入研究咖啡（驼孢）锈菌的病原生物学和遗传多样性对咖啡锈病的有效防控具有重要意义。文献表明,目前已鉴定出超过50个咖啡（驼孢）锈菌H.vatatrix生理小种,然而对于该种群在分子水平上遗传多样性的了解仍然知之甚少,特别是对于我国咖啡主栽区的咖啡锈菌主要致病类型（包括毒力基因的分布）以及分子水平上的遗传多样性仍然缺乏全面的认知。由于咖啡锈菌具有高度宿主专化性和强大的进化潜力,加之当前缺乏持久性抗源,因此咖啡锈病的防控难度很大。咖啡叶际微生物多样性受生物或非生物因素的影响,咖啡锈菌重寄生菌作为叶际微生物群落的重要组成部分,被认为是当前咖啡锈菌生物防治中的重要手段之一,然而由于来源不同的重寄生菌存在遗传差异导致过去咖啡锈菌重寄生菌生防制剂在咖啡锈病的防治中存在一定的局限性,因此,深入了解咖啡叶际微生物多样性,明确我国咖啡锈菌重寄生菌生防资源概况,特别是我国咖啡主栽区的咖啡锈菌重寄生菌遗传多样性分布情况,筛选鉴定针对我国咖啡主栽区的具有潜在生防效应的咖啡锈菌重寄生生防菌株,对咖啡锈病的综合防治具有重要意义。本研究首先从我国咖啡主栽区收集咖啡叶锈病病样,在超感病品种上对病原咖啡（驼孢）锈菌进行扩繁及单孢分离,对上述所获得的咖啡锈菌菌株进行毒力基因及生理小种鉴定,结果显示所有样品中共检测出三个生理小种类型,分别为ⅩⅩⅩⅦ（v2,5,6,7,9）,ⅩⅩⅩⅣ（v2,5,7,9）,New race（v2,5,6,7）,其中 New race（v2,5,6,7）小种未曾在国内外文献中报道过。新小种的出现表明咖啡锈菌已在基因型相近的寄主上发生一定程度的遗传分化。其次,从分子水平上研究咖啡（驼孢）锈菌的遗传多样性。针对咖啡（驼孢）锈菌的基因组数据筛选出SSR多态性位点,探索了中性基因以及与咖啡锈菌毒力相关的基因座多态性,结果显示以下SSR基因座位点在分别来自二倍体咖啡和四倍体咖啡的锈菌分离株之间存在差异:gSSRHV124（1462）TTTTG20,gSSRHV 143（1003）CTT13,gSSRHV98（1608）GGT15,gSSRHV1 19（1087）GT20,gSSRHV110（2144）TTTTTA7,ESTHv001179TTCT6,ESTHv00162TGA15,这些SSR基因座位点在咖啡锈菌种群中具有潜在的多态性,其分子标记的开发仍在探索中。对于中性基因β-Tub和TEF均未在测试的咖啡锈菌分离株中呈现多态性,而ITS、HVH4与毒力相关的效应子HVEC016在单个咖啡锈菌分离菌株中均出现不同的拷贝。鉴于此,本研究利用Illumina MiSeq测序平台对我国咖啡主栽区所收集到的与咖啡锈菌相关的病样的rDNA ITS1区进行扩增子高通量测序,通过该组数据进一步分析了我国咖啡锈菌分子水平上的遗传分化与分布情况,结果显示我国咖啡锈菌来源于同一个祖先,而后不断分化,形成目前的三个主要的遗传类型,其中两个类型内部也已出现不同方向的阶梯式遗传分化,咖啡锈菌在我国咖啡主栽区的遗传分布无明显的区域倾向性。该结果表明咖啡锈菌分子水平的遗传分化与其致病型/生理小种分化特征非常相似,从一定程度上体现了分子水平遗传进化途径与致病型/生理小种类型分化具有高度的关联性和一致性。然后对我国主栽品种小粒种咖啡Catimor衍生品种的叶际微生物群落多样性进行了研究,采用Illumina MiSeq测序平台对Catimor衍生品种叶际微生物群落的rDNA 16S V4+V5高变区和ITS1区域的扩增子进行高通量测序,结果表明不同地理位置下健康的Catimor衍生品种叶际微生物群落呈现显著性差异,差异程度与样本间的地理距离成正相关,微生物群落与地理因素（经纬度和海拔）之间的关联性分析显示,叶际细菌群落丰度与纬度的变化、叶际细菌群落多样性与海拔的变化、以及叶际真菌群落多样性与经度的变化具有一定的关联性,然而真菌群落丰度与地理因素的变异相关性较弱;咖啡锈菌及其重寄生菌的定殖显著影响咖啡叶际微生物群落组成结构,导致叶际细菌群落丰度和多样性指数上升,同时致使叶际真菌群落丰度和多样性指数下降;地理差异对于塑造咖啡叶际微生物群落多样性的驱动作用大于咖啡锈菌及其重寄生菌在叶片上定殖的影响。由于受到生物或非生物因素的影响,小粒种咖啡Catimor衍生品种叶际微生物群落缺乏主要的微生物群落组成成分。最后开展了咖啡锈菌重寄生菌遗传多样性的研究。从病样中收集可培养的咖啡锈菌重寄生菌,并进行分离纯化鉴定,筛选出103个菌株,其中45个菌株可以鉴定到种。通过一组与咖啡锈菌及其重寄生菌相关的叶际真菌群落rDNA ITS1区域高通量测序数据分析表明,绝大部分咖啡锈菌重寄生菌的遗传差异分布具有明显的区域倾向性,并且与咖啡叶片的发病症状密切相关。同时从收集到的咖啡锈菌重寄生菌株中共筛选到7种具有生防潜力的咖啡锈菌重寄生菌,分别为Simplicillium,Lecanicillium,Trichoderma,Purpureocillium lilacinum,Humicola fuscoatra,Mucor,Acremonium persicinum,而通过分离纯化共获得以下6种主要类型的咖啡锈菌潜在重寄生菌分离株,分别为 Simplicillium sp.,Hypocreales sp.（Lecanicillium）,Ascomycota sp.（Trichoderma）,Purpureocillium lilacinum,Humicola fuscoatra,Mucor sp.。研究发现,除了已报道的咖啡锈菌重寄生菌,部分咖啡内生真菌亦对咖啡锈菌同时具有重寄生作用,本研究结果首次明确了我国咖啡锈菌重寄生菌的种类及其在我国咖啡主栽区的整体分布情况,揭示了我国咖啡主栽区的咖啡锈菌重寄生菌存在高度的遗传多样性,并获得了一批潜在的咖啡锈菌重寄生菌生防菌株,对咖啡锈菌的生物防治具有重要的指导意义。总之本研究结果为全面深入了解我国咖啡锈菌、咖啡叶际微生物和咖啡锈菌重寄生菌的遗传多样性、咖啡锈菌重寄生菌生防制剂的开发和因地制宜科学应用,以及后续深入研究植物（寄主）-微生物（病原）-环境之间的互作机制和咖啡锈病防控奠定了坚实基础。