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目的:1.建立人源非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)A549常规分割(A549-2R)和大分割(A549-4R)放疗抗拒细胞系。2.明确细胞周期分布在A549-NC组、A549-2R组、A549-4R组不同放疗敏感性中的作用,并进一步探讨各组细胞周期分布差异的机制。方法:1.体外培养A549细胞,分别经6MV-X线常规照射(2Gy*17f)和大分割照射(4Gy*7f)筛选常规分割抗拒细胞系(A549-2R组)和大分割抗拒细胞系(A549-4R组)。2.流式细胞术检测A549-NC组、A549-2R组、A549-4R组在接受单次0Gy、2Gy、4Gy照射后细胞周期分布情况(PI单染)。3.基因芯片技术检测A549-NC组、A549-2R组、A549-4R组周期相关蛋白基因表达情况。4.Western-blot检测A549-NC组、A549-2R组、A549-4R组在接受单次0Gy、2Gy、4Gy照射后P53、P53 Ser15、P53 Ser20、P21、Cyclin D1、Cyclin D3、CDK2、CDK4、CDK6等周期相关蛋白表达情况。5.免疫组化技术检测NSCLC患者中Aurora A、P53、P21表达情况,进一步探讨P53、P21不同表达对患者预后的影响。结果:1.通过多分割照射可获得放疗抗拒细胞系。在细胞形态上,A549-2R组和A549-4R组细胞均较A549-NC组细胞变长变细,呈细长条状,胞浆浑浊,边缘毛糙,细胞间隙增大,且A549-4R组较A549-2R组更明显。2.流式细胞术结果显示,在基础状态下(未接受单次射线刺激),A549-2R组与A549-NC组细胞周期分布无明显差异;A549-4R组与A549-NC组比较,G1期细胞明显减少而S期细胞明显增多,提示A549-4R组增殖潜能及DNA修复潜力增加。接受单次放疗刺激后,A549-NC组可激活G1/S期阻滞使细胞停滞于G1期,表现为G1期细胞增多而S期和G2期细胞减少。而A549-2R组和A549-4R组G1/S期检查点失效,DNA损伤后不能诱导细胞停滞于G1期,表现为G1期细胞比例不变或减少、S期和G2期细胞增多;A549-NC组、A549-2R组和A549-4R组均可诱导G2/M期阻滞,表明A549-2R组和A549-4R组G2/M期检查点仍可正常运行。3.基因芯片结果显示,A549-NC组与A549-2R组相比,2R组cyclin D和cyclin E表达升高2倍以上,而P53、P21、CDK2、CDK4、CDK6表达无差异;A549-NC组与A549-4R组比较,4R组CDK4、CDK6和cyclin E表达升高2倍以上,而P53、P21、CDK2、cyclin D表达无差异;A549-2R组与A549-4R组比较,4R组P21表达降低2倍以上,而P53、CDK2、CDK4、CDK6、cyclin D、cyclin E表达无明显差异。4.Western Blot结果显示,A549-NC组、A549-2R组和A549-4R组P53、P53Ser15、P53 Ser20及P21总蛋白表达无明显差异;而胞浆P21蛋白在NC、2R、4R组表达逐渐增高,且在各组随着放疗剂量增加表达增高。A549-2R组和A549-4R组CDK6和cyclin D1表达均较A549-NC组明显升高,而CDK2、CDK4和cyclin D3表达无明显差异。A549-2R组和A549-4R组间周期相关蛋白表达无明显差异。5.免疫组化结果显示,58例NSCLC患者中Aurora A、P53及P21表达阳性率分别为89.7%(52/58)、46.6%(27/58)、31.0%(18/58)。Aurora A与淋巴结转移率相关,即高表达者淋巴结转移率高(69.2%vs.37.8%,P=0.045)。单因素分析,Aurora A低表达组OS明显优于高表达组,1、2、3年生存率分别为90%vs.80.3%,77%vs.50.5%,75%vs.46%(P=0.039);P53低表达组OS明显优于高表达组,1、2、3年生存率分别为91.9%vs.83.4%,82.3%vs.57.5%,80.6%vs.55.6%(χ2=4.39,P=0.036),差异有统计学意义。P21低表达组OS明显优于高表达组,1、2、3年生存率分别为92.0%vs.77.8%,80%vs.50%,77.5%vs.50%(χ2=4.56,P=0.033),差异有统计学意义。结论:1.A549-2R组放疗抗拒可能与cyclin D1过表达导致的G1/S期检查点失效有关,胞浆中过表达的P21通过辅助cyclin D-CDK4/6结合进一步促进G1/S期转换。2.A549-4R组放疗抗拒与G1/S期检查点失效、S期细胞积聚均有关。A549-4R组G1/S期检查点失效与A549-2R组相同,即与cyclin D1及胞浆P21蛋白过表达有关。此外,A549-4R组S期细胞增多、增殖潜能增强及DNA修复潜力增加进一步增加其放疗抗拒性。3.A549-2R组、A549-4R组P53-P21介导的G2/M期阻滞仍能正常运行。4.Aurora A、P53、P21可作为NSCLC患者的预后指标,Aurora A、P53、P21为NSCLC患者的不良预后指标。