论文部分内容阅读
[目的]探索牙龈间充质干细胞作为骨组织工程种子细胞的可行性,以及TGF-β抑制剂SB431542对牙龈间充质干细胞体外增殖和体内外成骨分化的影响。[方法]收集临床种植二期手术及口腔颌面外科阻生智齿拔除术中切除的健康废用牙龈组织,进行原代细胞的分离培养。应用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测间充质干细胞表面标志物CD73、CD90及造血干细胞表面标志物CD34、CD45的表达,并检测其成骨定向分化能力,进行其为间充质干细胞的生物学鉴定;通过CCK-8增殖实验检测GMSCs的增殖能力以及1 μM SB431542对GMSCs增殖的影响;细胞随机分为三组:空白组细胞给予间充质干细胞培养基、对照组细胞给予干细胞成骨诱导培养基、实验组细胞给予添加1 μM SB431542的间充质干细胞成骨诱导培养基,进行成骨分化的诱导;茜素红染色检测三组细胞在添加不同培养基体外培养21天后的矿化结节形成情况,拍照并利用Image Pro Plus 6.0软件进行图形分析,利用GraphPad Prism 7软件进行数据分析;通过RT-PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)检测三组细胞碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)、Runt 相关转录因子 2(Runt-related transcription factor-2,Runx2)、COL-I 的表达,并利用GraphPadPrism7软件进行数据分析。设计小型猪自身对照实验,每只小型猪设计四个分组,分别为:自体骨组(回植环钻去除的颌骨)、Bio-Oss组(植入Bio-Oss骨粉)、GMSCs组(植入Bio-Oss骨粉与GMSCs复合植骨材料)、SB组(植入Bio-Oss骨粉与SB431542诱导的GMSCs复合植骨材料)。术中于每只小型猪口腔内上颌骨以8 mm为间隔,环钻制备直径12 mm,深5 mm的骨缺损,制备四个骨缺损,分别将四组植骨材料植入骨缺损内,覆以海奥生物膜。8周后处死小型猪取材,并对骨再生区域进行CBCT、micro CT、检测及HE染色,分析SB431542对GMSCs体内成骨分化的影响。[结果]采用改良组织块法获取原代细胞,传代后见细胞贴壁生长,细胞形态、大小基本一致,呈长梭形,胞质均匀,胞核圆,位于细胞中间,呈典型的成纤维细胞状态,且增殖速度较快,具有克隆形成能力及成体干细胞的特征;流式细胞仪分析显示,间充质干细胞表面标志物CD73(99.4%)、CD90(99.7%)阳性表达,造血干细胞表面标志物CD34(0.2%)、CD45(0.1%)阴性表达,符合间充质干细胞表面特征;CCK-8检测结果显示:添加1μM SB431542的GMSCs与对照组GMSCs增殖能力差异无统计学意义(P>0.05);RT-PCR检测结果显示,实验组ALP、OCN、Runx2、OPN、COL-I各成骨相关基因的表达水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);茜素红染色结果显示,实验组细胞的矿化结节形成量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);CBCT和microCT影像可见所有骨缺损位点均有不同程度骨组织再生表现,骨密度(BD)分析显示自体骨组最接近正常骨组织,SB组测得的BD均高于GMSCs组,Bio-Oss组成骨效果最差;HE染色结果显示:术后2月,自体骨组成骨接近正常骨,SB组中见大块新生骨样组织;GMSCs组见少量新生骨样组织,Bio-Oss组见均质红染的骨基质;SB组染色较GMSCs组及Bio-Oss组更明显。[结论]本研究结果通过体外增殖、成骨分化染色、成骨基因表达水平检测,体内HE染色、micro CT、CBCT检测,提示牙龈间充质干细胞可以作为骨组织工程种子细胞可靠来源,且SB431542可以通过调控成骨基因的表达,提高牙龈间充质干细胞的体外和体内成骨能力,而对增殖无明显影响,为组织工程再生提供了新的思路。