论文部分内容阅读
目的:胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤,在我国其死亡率居恶性肿瘤之首。化疗作为肿瘤术后最有效的辅助治疗手段,在防治肿瘤的复发与转移方面有着举足轻重作用。奥沙利铂（Oxaliplatin,L-OHP）是继顺铂和卡铂之后的第三代铂类抗肿瘤药,已逐渐作为治疗进展期胃癌的主要药物,且显示出良好的应用前景。虽然目前胃癌的化疗方案不断完善,但部分胃癌患者对化疗的疗效并不理想,其中多药耐药（multidrug resistance, MDR）是导致化疗失败的根本所在。随着肿瘤免疫学、分子生物学和基因工程技术的飞速发展,细胞因子疗法作为抗肿瘤的分子治疗学手段受到国内外学者的广泛关注,呈现出良好的前景。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine- induced killer,CIK）是一种新型、高效、广谱的免疫活性细胞,研究表明,CIK细胞具有较强的体内外抗胃癌细胞活性,有可能用于临床上进展期胃癌的过继免疫治疗。而且免疫效应细胞对MDR肿瘤细胞的杀伤活性较其对亲本细胞相似甚至更高。目前关于CIK细胞联合化疗对MDR肿瘤细胞体内外杀伤作用的研究较少。本研究在建立人胃癌高侵袭转移奥沙利铂耐药细胞OCUM-2MD3/L-OHP的基础上,应用病理形态学以及MTT等方法,观察CIK细胞联合L-OHP对胃癌高侵袭转移奥沙利铂耐药细胞OCUM-2MD3/L-OHP的体外抗肿瘤作用,为临床应用CIK细胞联合化疗治疗耐药性胃癌提供实验依据。材料及方法:1材料1.1实验细胞:人胃癌高侵袭转移细胞株OCUM-2MD3,由日本大阪医科大学外一科八代正和教授惠赠。人胃癌高侵袭转移奥沙利铂耐药细胞株OCUM-2MD3/L-OHP,由本科室培养建立,耐药指数（resistant index,RI）4.3,且传代或冻存3个月后复苏仍维持相似的耐药性。耐药蛋白P-gp其在耐药细胞系中的表达高于亲本细胞系。将两种细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养液中,37℃,5%CO2孵育培养,分别取对数生长期的两种细胞,配制成浓度为1×106个/mL的细胞悬液备用。1.2实验药物:奥沙利铂（Oxaliplatin,L-OHP）,江苏恒瑞制药厂生产,0.9%生理盐水稀释成1200μg/mL、600μg/mL、300μg/mL、150μg/mL、75μg/mL备用。1.3效应细胞（CIK细胞）的制备和体外扩增:取正常人的外周肝素抗凝血,经淋巴细胞分层液密度梯度离心分离PBMC,PBS洗涤后细胞被重悬并保存于由RPMI-1640、10%人AB血清、25mmol/LHEPES、2mmol/L-谷氨酰胺、100μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素、50μmol/L 2-巯基乙醇组成的培养液中,PBMC调至1×106/mL后,第一天加入浓度为100μg/mL的rhIFN-γ,孵育24小时后,加入浓度为50μg/mL CD3McAb、100U/mL的rhIL-1和300U/mL rhIL-2,放置37℃,5%CO2孵箱中培养,细胞每2天更换新鲜培养液传代培养,同时补加rhIL-2 1000U/ mL,细胞第14天收获,用前调整效靶比为40:1,20:1和10:1。2分组（各组均以OCUM-2MD3细胞作为对照）2.1 L-OHP干预组:计算单独应用不同浓度的L-OHP对OCUM-2MD3/L-OHP细胞24h、48h、72h的体外杀伤活性。2.2 CIK细胞干预组:OCUM-2MD3/L-OHP细胞作为效应细胞,CIK细胞作为靶细胞,计算单独应用不同效靶比CIK细胞对OCUM-2MD3/L-OHP细胞12h、24h、48h的体外杀伤活性。2.3 CIK细胞联合L-OHP干预组:按效靶比40:1加入CIK后12h后再加入不同浓度L-OHP,24h后计算两者的联合应用对OCUM-2MD3/L-OHP细胞的体外杀伤活性。3方法3.1应用倒置相差显微镜观察以上三组中OCUM-2MD3/ L-OHP细胞的病理形态学变化。3.2应用MTT法检测以上三组在570nm波长处光密度（OD）值,分别计算不同时间L-OHP、CIK细胞单独以及两者联合应用对OCUM-2MD3/L-OHP细胞的体外杀伤活性。4统计方法实验数据用SPSS 12.0统计软件处理,P<0.05时认为差异具有显著性。结果:1体外杀伤活性的病理形态学观察倒置相差显微镜下OCUM-2MD3/L-OHP细胞系与OCUM-2MD3细胞系细胞相比,形态无明显区别。1.1 L-OHP对OCUM-2MD3/L-OHP细胞体外杀伤活性的病理形态学观察倒置显微镜下观察,将OCUM-2MD3/L-OHP细胞加药培养24h后细胞数目稍有减少,排列疏松,细胞形态变圆,体积变小,折光性差,核浆比变大,出现飘浮的细胞,且胞浆内可见较多颗粒;培养48h后细胞数目继续减少,胞浆内颗粒增多,且可见细胞碎片;培养72h后细胞数目继续减少,可见较多细胞碎片。L-OHP对OCUM-2MD3细胞的杀伤作用强于OCUM-2MD3/L-OHP细胞,各时段OCUM-2MD3细胞减少数目及细胞碎片的量远大于OCUM-2MD3/L-OHP细胞。对照组胃癌细胞仍贴壁生长,状况良好。1.2 CIK细胞对OCUM-2MD3/L-OHP细胞体外杀伤活性的病理形态学观察CIK细胞为悬浮生长细胞,呈圆形,细胞生长活跃时抱团率增加。在倒置显微镜下观察到CIK细胞具有一定的方向性运动能力,逐渐聚集到OCUM-2MD3/L-OHP细胞周围,OCUM-2MD3/L-OHP细胞胞浆内出现颗粒状物,细胞逐渐模糊、消失,使贴壁生长的癌细胞出现漂浮。效靶细胞共育12h时OCUM-2MD3/L-OHP细胞数明显减少,24h细胞明显漂浮,并且在培养液中出现碎片。48h在培养液中出现大量碎片。CIK细胞对OCUM-2MD3细胞的杀伤作用与OCUM-2MD3/L-OHP细胞相似。对照组胃癌细胞仍贴壁生长,状况良好。单独CIK细胞未见趋动现象,均匀铺满视野。1.3 CIK细胞联合L-OHP对OCUM-2MD3/L-OHP细胞的体外杀伤活性的病理形态学观察倒置显微镜下观察, CIK细胞逐渐聚集到OCUM-2MD3/L-OHP细胞周围,OCUM-2MD3/L-OHP细胞胞浆内出现颗粒状物,细胞逐渐模糊、消失,使贴壁生长的癌细胞出现漂浮,效靶细胞共育12h时OCUM-2MD3/L-OHP细胞数明显减少,加入L-OHP后,胞浆内颗粒增多,可见大量细胞碎片,CIK细胞联合L-OHP对OCUM-2MD3细胞的杀伤作用与OCUM-2MD3/L-OHP细胞相似。2体外杀伤活性的MTT法检测结果2.1 L-OHP对OCUM-2MD3/L-OHP细胞的体外杀伤活性24h时,L-OHP对OCUM-2MD3细胞作用的IC50为111.3μg/mL,对OCUM-2MD3/L-OHP细胞作用的IC50为354.4μg/mL,OCUM-2MD3/L-OHP对L-OHP的耐受性较亲代敏感株OCUM-2MD3增加了3.2倍。48h时,L-OHP对OCUM-2MD3细胞作用的IC50为71.2μg/mL,对OCUM-2MD3/L-OHP细胞作用的IC50为235.2μg/mL,OCUM-2MD3/L-OHP对L-OHP的耐受性较亲代敏感株OCUM-2MD3增加了3.3倍。72h时,L-OHP对OCUM-2MD3细胞作用的IC50为522.3μg/mL,对OCUM-2MD3/L-OHP细胞作用的IC50为1057.0μg/mL,OCUM-2MD3/L-OHP对L-OHP的耐受性较亲代敏感株OCUM-2MD3增加了2.0倍。L-OHP对OCUM-2MD3/L-OHP细胞和OCUM-2MD3细胞的体外杀伤活性在48h最强。且随L-OHP浓度的增加而增强。2.2 CIK细胞对OCUM-2MD3/L-OHP细胞的体外杀伤活性12h时,CIK细胞对耐药细胞株OCUM-2MD3/L-OHP的杀伤活性明显高于其亲代敏感株OCUM-2MD3（P<0.05）。且杀伤活性随效靶比的增高而增强。24h时,CIK细胞对OCUM-2MD3/L-OHP的杀伤活性明显高于OCUM-2MD3（P<0.05）。且杀伤活性随效靶比的增高而增强。48h时,CIK细胞对OCUM-2MD3/L-OHP的杀伤活性明显高于OCUM-2MD3（P<0.05）。且杀伤活性随效靶比的增高而增强。CIK细胞对两种靶细胞的杀伤活性均在24h最高,且杀伤活性随效靶比的增高而增强,CIK细胞在各时间段对耐药细胞株OCUM-2MD3/L-OHP的杀伤活性,均明显高于其亲代敏感株OCUM-2MD3（P<0.05）。提示与OCUM-2MD3细胞相比,CIK细胞对OCUM-2MD3/L-OHP细胞有较强的体外杀伤活性。2.3 CIK细胞联合L-OHP对OCUM-2MD3/L-OHP的体外杀伤活性CIK细胞联合L-OHP对OCUM-2MD3/L-OHP细胞和OCUM-2MD3的体外杀伤活性均较单纯使用L-OHP或CIK细胞的杀伤活性明显增加（P<0.05）。联合杀伤活性的大小随L-OHP浓度的升高而增加。联合CIK细胞治疗后,L-OHP对OCUM-2MD3和OCUM-2MD3/L-OHP细胞作用的IC50降低。与OCUM-2MD3细胞相比,CIK细胞联合L-OHP对人胃癌高侵袭转移耐药细胞株OCUM-2MD3/L-OHP具有明显的协同作用（P<0.05）。结论:1与亲本细胞OCUM-2MD3相比,耐药细胞OCUM-2MD3/ L-OHP在形态学上无明显区别。L-OHP对之作用后,胞浆内颗粒增多,且可见细胞碎片;CIK细胞作用后,细胞胞浆内出现颗粒状物,细胞逐渐模糊、消失。两者联合作用后效果更明显。2与OCUM-2MD3细胞相比,L-OHP对OCUM-2MD3/L-OHP细胞的体外杀伤活性较低。L-OHP对OCUM-2MD3/L-OHP细胞和OCUM-2MD3细胞的体外杀伤活性均随L-OHP浓度的增加而增强,且在给药后48h最高。3与OCUM-2MD3细胞相比,CIK细胞对OCUM-2MD3/ L-OHP细胞的体外杀伤活性较高。CIK细胞的杀伤活性随效靶比的增高而增强。CIK细胞对两种靶细胞的杀伤活性均在24h最高。4与单用L-OHP或CIK细胞作用相比,CIK细胞联合不同浓度的L-OHP对两种肿瘤细胞的杀伤活性均明显升高。且与OCUM-2MD3细胞相比,CIK细胞联合L-OHP对OCUM- 2MD3/L-OHP具有更明显的协同杀伤作用。