研究背景和目的：乳腺癌发病率占全球女性肿瘤的第一位（占女性全部癌症病例数的23%）,且乳腺癌导致的患者死亡比例占所有肿瘤引起死亡的14%；在我国,乳腺癌发病率亦呈上升趋势。三阴性乳腺癌（TNBC）是一种特殊的乳腺癌类型,其细胞ER、PR和Her2表达均为阴性,该类型约占女性乳腺癌发病率的12～17%。目前,针对TNBC临床上尚无非常有效的治疗方法,并且肿瘤转移（骨、脑、肺部转移）是导致患者死亡的主要原因,因此,为TNBC患者寻找新的有效治疗方式显得尤为重要。自噬是个分解代谢的过程,涉及氨基酸、核苷酸和脂质的循环：多余的蛋白质或受损的细胞器等被双层膜囊泡（自噬体）包裹,在溶酶体内降解。通过此途径,自噬能引起错误折叠的蛋白、蛋白质聚集体及破坏的细胞器如能伤害细胞的线粒体和内质网等的去除。近来,已有学者证实自噬功能紊乱与肿瘤的形成和生长有关。目前认为,自噬能力下降可增加正常细胞的癌变风险；而对于已癌变细胞,适度自噬可促进细胞存活,而过度自噬则可引发细胞死亡。Beclin1是诱导细胞自噬的必须基因,是凋亡调控蛋白BH-3亚家族的成员之一,该基因主要位于染色体17q21,其对肿瘤细胞的自噬发挥重要的调控作用。同时,beclin1亦是一种抑癌基因,有研究表明,存在beclin1等位失活的小鼠罹患肿瘤的风险明显增高,而过表达beclin1诱导自噬可抑制肿瘤的形成和发展。关于beclin1基因在乳腺癌方面的研究很少。已有研究表明,45～70%散发性乳腺癌患者癌细胞存在beclinl等位基因缺失。该等位基因缺失可降低正常乳腺上皮细胞的自噬能力,并增加应激环境下基因的不稳定性,从而促使细胞无序增殖,被认为是乳腺癌发生的关键因素；同时,beclin1等位缺失可能会引起乳腺癌细胞自噬能力下降,基因不稳定性增加,从而导致癌细胞的进一步恶性增殖。目前,关于自噬在TNBC方面的研究更少。有学者发现,][NBC细胞株存在beclin1等位基因缺失,由此推测,该等位基因缺失可能与此类癌细胞自噬能力下降、增殖能力旺盛和转移能力增强有关。恶性肿瘤的转移是其最特征性的生物学标志之一,主要过程如下：肿瘤细胞通过脱离原发病灶,降解细胞外基质,穿透基底膜进入血管（淋巴管）成为循环肿瘤细胞,渗出血管（淋巴管）并重新定居,进而形成转移灶。上皮间质转化（EMT）是上皮细胞获得运动迁徙能力、脱离原发病灶的一个主要途径,是在特殊诱导因子作用下细胞由上皮表型转化成间质表型的过程。在EMT过程中,上皮标志物如E-钙黏蛋白（E-cadherin）、α-连环素（a-catenin）、紧密连接蛋白（ZO-1）等表达下调,而间质标志物如N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、纤维连接蛋白（Fibronectin）等表达上调。通过EMT,上皮细胞失去了细胞极性,失去与基底膜的连接等上皮表型,获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型。目前认为,肿瘤细胞发生EMT是微环境中作用因子和肿瘤细胞相互作用的结果,导致细胞信号通路和基因表达发生改变,最终使肿瘤细胞更富于侵袭性而利于转移。发生EMT的肿瘤细胞具有干细胞属性,如发生EMT的乳腺癌细胞带有CD44高表达、CD24低表达,且有不断自我更新的能力,提示它们已具有乳腺癌干细胞特性。同时,利用无血清悬浮培养法筛选出的乳腺癌干细胞亦具有EMT特征。EMT是一个高度复杂的过程,其所涉的调节机制也同样复杂,主要与TGF-p信号通路、Wnt信号通路、PI3K/AKT信号通路及受体酪氨酸激酶Ras-MAPK信号通路等有关。三阴性乳腺癌BT549细胞存在beclin1等位基因缺失,前期我们已证实,转染beclin1基因后于常氧及低氧条件下可抑制BT549细胞的增殖、降低其迁移能力和促进自噬。由此,我们进一步设想,在常氧及低氧条件下,乳腺癌BT549细胞过表达beclin1基因是否通过改变细胞EMT的特性,从而降低细胞的远处转移能力。此次研究旨在探讨beclin1基因与EMT的关系,为临床上预防和治疗TNBC转移提供重要的理论依据及寻找新的治疗靶点。方法：1pLenO-GTP使用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ进行酶切,酶切获得的载体片段做载体去磷；按照beclin1基因的序列（NM₀03766.3）,设计PCR引物扩增beclin1基因CDS区域；将pLenO-GTP载体酶切产物和beclin1基因PCR产物加样到1%的琼脂糖胶进行电泳鉴定,鉴定后将beclin1的PCR产物做胶回收,并与pLenO-GTP载体进行连接反应后准备转化；从新活化的E.coli DH5a菌平板上挑取一单菌落,用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞悬液,并直接用于转化实验；根据Axygen质粒抽提试剂盒方法抽提质粒,重组慢病毒载体pLenO-GTP-Beclin1使用EcoRⅠ和Not Ⅰ进行酶切鉴定,并送公司测序,测序结果比对。将正确的重组慢病毒穿梭载体质粒及其辅助包装原件载体质粒分别进行高纯度无内毒素抽提,共转染293T细胞,培养72h后,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,感染293T细胞后检测病毒滴度。浓度梯度为0ug/ml、0.5ug/ml、1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml的嘌呤霉素分别作用于BT549细胞,3天后用倒置显微镜观察细胞死亡情况,BT549细胞全部死亡的嘌呤霉素最低浓度即为其筛选BT549细胞的工作浓度。用不同的感染复数（MOI=5、10、15、20）分别感染三阴性乳腺癌BT549细胞,96h后用倒置荧光显微镜在对应的激发光波长下观察绿色荧光表达的情况,评估感染效率；将三阴性乳腺癌BT549细胞分为空白对照组、实验对照组（pLenO-GTP Vector）及实验组（pLenO-GTP-Beclin1Vector）,慢病毒以感染效率为100%的MOI值20感染BT549细胞传3代后,Western blot和激光共聚焦显微镜分别检测各组细胞内beclin1蛋白的表达情况；2Western blot法检测常氧条件下各组细胞EMT相关标志物（上皮标志物E-cadherin,间皮标志物N-cadherin、Vimentin）蛋白的表达情况及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白（p-catenin、Snail、p-GSK-3β）的表达水平；三气培养箱（1%02、94%N2、5%CO2）低氧培养各组细胞12h、24h后采用荧光定量PCR检测EMT相关标志物（上皮标志物E-cadherin,间皮标志物N-cadherin、Vimentin、 Fibronectin）mRNA表达水平,Western blot法及激光共聚焦显微镜检测EMT相关标志物（上皮标志物E-cadherin,间皮标志物N-cadherin、Vimentin）的蛋白表达水平,以评估短程低氧条件下beclin1基因对细胞EMT相关标志物转录和翻译水平的影响；最后,用Western blot法检测各组细胞低氧培养24h后Wnt/β-catenin信号通路的相关蛋白（β-catenn、Snail、p-GSK-3β）表达水平。应用SPSS18.0软件进行统计学分析,RT-PCR、Western blot及激光共聚焦图片荧光分析结果以均数±标准差（x±s）表示,两样本t检验分析低氧时间对细胞EMT相关标志物的表达情况,余计量资料用方差分析进行统计。P<0.05认为差异有统计学意义。结果：1PCR鉴定和酶切鉴定结果：重组慢病毒载体pLenO-GTP-beclin1的插入序列完全正确,测序结果提示beclin1慢病毒2号克隆为鉴定正确的阳性克隆;慢病毒包装后,使用逐孔稀释滴度测定法得到,对照慢病毒的滴度为1.0x1012TU/ml,beclin1慢病毒的滴度为3×109TU/ml；嘌呤霉素浓度为3ug/ml时,3天后BT549细胞全部死亡,即嘌呤霉素筛选BT549细胞的工作浓度是3ug/ml；随着感染复数MOI值逐渐增大,感染效率逐渐增高,当感染复数MOI值为20时,慢病毒对BT549细胞的感染效率最高,几乎为100%；Western blot结果显示实验组beclin1蛋白印迹条带灰度明显强于空白对照组和实验对照组（F=38.830,P=0.000）,而空白对照组和实验对照组beclin1蛋白印迹条带灰度极淡,空白对照组和实验对照组间差异无统计学意义（P>0.05）；激光共聚焦显微镜结果显示实验组BT549细胞内beclin1蛋白荧光强度显著高于空白组和实验对照组,而空白组和实验对照组的beclin1蛋白荧光强度很弱,空白对照组和实验对照组间差异无统计学意义（P>0.05）。2Western blot结果显示,相对于空白对照组和实验对照组,常氧条件下实验组细胞的上皮标志物E-cadherin蛋白表达水平上调（G=36.583,P=0.000）,间皮标志物N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平下调（N-cadherin F=31.638、 P=0.001,Vimentin F=50.332、P=0.000）,而空白对照组和实验对照组间差异无统计学意义（P>0.05）；常氧条件下实验组Wnt/β-catenin信号通路的β-catenin、 Snail蛋白水平下调（β-catenin F=59.025,P=0.000; Snail F=81.838,P=0.000）,而p-GSK-3β的蛋白水平上调（F=70.033,P=0.000）,而空白对照组和实验对照组间差异无统计学意义（P>0.05）。3短程低氧条件下,相对于空白对照组、实验对照组,实验组细胞的上皮标志物E-cadherin mRNA和蛋白表达水平上调（12h：F1=122.451、P1=0.000,F2=29.651、P2=0.001；24h：F1=108.783、P1=0.000,F2=41.232、P2=0.000；F1、P1和F2、P2分别为mRNA和蛋白表达水平的统计结果）,而间皮标志物N-cadherin、Vimentin、Fibronectin表达水平下调（12h:N-cadherin F1=92.918、 P1=0.000、F2=138.034、P2=0.000,Vimentin F1=135.313、P1=0.000、F2=39.765、 P2=0.000,Fibronectin F1=144.275、P1=0.000;24h:N-cadherin F1=76.064、P1=0.000、F2=40.614、P2=0.000,Vimentin F1=206.576、P1=0.000、F2=46.658、P2=0.000,Fibronectin F1=411.405、P1=0.000）；相对于低氧培养12h,各组细胞低氧培养24h后E-cadherin表达水平下调（空白对照组：t1=4.266、P1=0.013,t2=11.235、P2=0.000；实验对照组：t1=10.463、P1=0.000,t2=4.092、P2=0.009；实验组：t1=28.208、P1=0.000,t2=7.262、P2=0.001；t1、P1和t2、P2分别为mRNA和蛋白表达水平的统计结果）,而N-cadherin（实验组除外）、Vimentin、Fibronectin表达水平上调（空白对照组：N-cadherint1=3.072、P1=0.037、t2=7.146、P2=0.002, Vimentin t1=6.384、P1=0.003、t2=7.476、P2=0.002,Fibronectin t1=8.389、P1=0.001;实验对照组：N-cadherin t1=2.805、P1=0.049、t2=5.352、P2=0.006, Vimentint1=12.701、P1=0.000、t2=5.923.P2=0.004,Fibronectin t1=7.318、P1=0.002；实验组：N-cadherin t1=7.849、P1=0.001、t2=1.987.P2=0.184,Vimentin t1=11.097、 P1=0.000、t2=13.626、P2=0.000,Fibronectin t1=11.003、P1=0.000）；beclinl基因与低氧条件对BT549细胞E-cadherin、N-cadherin的表达水平有交互效应（E-cadherin F1=19.175、P1=0.000,F2=5.588、P2=0.015；N-cadherin F1=8-238、 P1=0.006,F2=5.934.P2=0.016）；低氧培养24h后,实验组Wnt/β-catenin信号通路的p-catenin、Snail蛋白水平下调（β-catenin F=18.169,P=0.003；Snail F=11.098,P=0.010）,而p-GSK-3β的蛋白水平上调（F=36.096,P=0.000）结论：1成功建立了慢病毒介导的稳定表达beclin1的三阴性乳腺癌BT549细胞；嘌呤霉素筛选BT549细胞的工作浓度是3ug/ml。2常氧及短程低氧条件下,beclin1基因抑制BT549细胞EMT,而随时间的增加低氧促进EMT。3Beclin1基因在常氧及短程低氧条件下抑制BT549细胞EMT的机制可能与Vnt/β-catenin信号通路有关。