梅花锌指蛋白基因PmZAT12和PmBBX32在低温胁迫下的功能研究

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梅(Prunus mume)品种繁多,花姿丰富。由于受北方冬季低温的限制,大多数品种不能露地过冬,因此培育出抗寒性更强的梅花,有极其重要的园林应用价值和广阔的市场前景。锌指蛋白是一类通过调控下游基因的表达来影响植物的生长发育和应答低温胁迫,具有“手指状”结构域的转录因子。本研究基于‘雪梅’叶片4℃低温处理下的基因表达谱和梅花基因组数据,克隆了梅花5个C2H2型和1个BBX型锌指蛋白基因,分析6个目的基因在低温胁迫下的表达变化,构建6个超量表达载体并分别转化拟南芥,通过对转基因拟南芥植株的低温胁迫处理,初步确定其抗寒性功能,并对超表PmBBX32基因拟南芥进行了相关生理指标测定和基因表达分析。主要研究结果如下:1、从‘雪梅’叶片克隆5个C2H2型锌指蛋白基因(PmZAT9、PmZAT10A、PmZAT10B、PmZAT11、和PmZAT12)和1个BBX型锌指蛋白基因(PmBBX32)并进行低温诱导下的表达量检测。结果表明,这6个目的基因对低温诱导都有不同程度的响应。在C2H2型锌指蛋白基因中PmZAT12和PmZAT10A对低温诱导的响应比另外3个基因(PmZAT9、PmZAT10B和PmZAT11)强烈;BBX型锌指蛋白基因PmBBX32对低温诱导有微弱响应。2、构建6个目的基因的超量表达载体,分别转化拟南芥。得到了转PmZAT9、PmZAT12和PmBBX32基因的T3代纯合株系,转PmZAT10A基因的T2代单拷贝株系,转PmZAT10B和PmZAT11 T1代阳性苗。3、转基因拟南芥低温抗性鉴定。与野生型相比,低温处理下超表PmZAT12基因的拟南芥株系存活率降低,超表PmBBX32基因的株系存活率提高,而PmZAT9和PmZAT10A的超表株系的存活率与野生型相比并无显著差异。4、转PmBBX32基因拟南芥生理指标检测和基因表达分析。与野生型拟南芥相比,转PmBBX32基因拟南芥具有更低的相对电导率和ROS积累量,以及更高的抗氧化酶活性和脯氨酸含量,说明PmBBX32基因的超表降低了低温对植株的伤害,同时可能通过提高抗氧化酶活性和脯氨酸的含量增强了植株的抗寒性。此外RT-PCR结果表明超表PmBBX32可以上调冷胁迫和SOD相关基因的表达,从而提高植株的抗寒性。5、超表PmZAT12和PmBBX32拟南芥开花表型分析。形态指标统计结果表明,超表PmZAT12和PmBBX32拟南芥的开花时间明显晚于野生型,并且均具有矮化特征。并且转基因拟南芥开花时莲座叶叶片数量与野生型相比显著增多,推测转基因拟南芥的表型可能是与植物本身的发育缓慢有关。
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