论文部分内容阅读
目的：(一)采用免疫组织化学法检测皮肤鳞状细胞癌(SCC)患者组织中Survivin和Caspase-3蛋白的表达,并分析其与临床病理因素的关系,探讨Survivin和Caspase-3在SCC发生发展中的作用。(二)以皮肤鳞状细胞癌A431细胞株作为研究对象,进行体外实验,初步观察雄黄对皮肤鳞状细胞癌A431细胞株抑制增殖及诱导凋亡的作用及机制,为应用雄黄治疗SCC提供理论和实验依据。方法：(一)对2007-2009年期间收集的46例皮肤鳞癌患者进行临床资料分析,经组织病理确定并组织分级；采用免疫组化法检测患者组织中Survivin及Caspase-3蛋白的表达及其与临床和病理的关系。(二)以皮肤鳞状细胞癌A431细胞株作为研究对象,在37℃、100%湿度、5%CO2孵箱单层传代培养,培养基为含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/mlml链霉素的DMEM培养液,MTT法检测雄黄对体外培养的皮肤鳞癌A431细胞株增殖抑制作用；流式细胞仪检测雄黄对体外培养的皮肤鳞癌A431细胞株诱导凋亡的作用；RT-PCR法检测雄黄对体外培养的皮肤鳞癌A431细胞株Survivin及Caspase-3 mRNA表达量的改变。结果：(一)组织病理学诊断结果组织病理学结果显示,本组46例患者组织病理均有不规则肿瘤细胞团块构成的癌巢,侵入真皮网状层或更深；根据Broder分级标准,Ⅰ级鳞癌15例,占32.6%；Ⅱ级鳞癌17例,占37.0%,即高分化鳞癌32例,占69.6%；Ⅲ-Ⅳ级鳞癌即低分化鳞癌14例,占30.4%。所有病例手术切缘彻底。对照组标本20例,均取材于手术切除的正常面部、腹部及外阴部皮肤。(二)免疫组化结果1.Survivin蛋白在鳞癌组织中的表达Survivin蛋白主要表达于细胞浆,癌组织中多呈弥漫性分布,在鳞癌组织内及正常对照皮肤组织中Survivin阳性表达率分别为69.57%(32/46)、0.0%(0/10),二者相比较差异有统计学意义(P<0.01)；在高分化鳞癌及低分化鳞癌组织中的表达率分别为59.38%(19/32)、92.86%(13/14),二者之比差异有统计学意义(P<0.01)。2.Caspase-3蛋白在鳞癌组织中的表达Caspase-3的蛋白表达主要在细胞浆。在皮肤鳞癌组织及正常皮肤组织中Caspase-3阳性表达率分别为36.96%(17/46)和90.00%(18/20)；在高分化鳞癌及低分化鳞癌组织中的表达率分别为43.75%(14/32)、21.43%(3/14),二者之比差异无统计学意义P>0.05)。3.鳞癌组织Survivin和Caspase-3表达的关系32例Survivin表达阳性组织中有8例Caspase-3表达阳性(8/32,25.00%),而14例Survivin表达阴性组织中有9例Caspase-3阳性表达(9/14,64.29%),二者表达均为阴性者5例,Survivin与Caspase-3的表达呈显著负相关(r=-0.375,P<0.05)。(三)雄黄对皮肤鳞状细胞癌A431细胞株的体外干预实验结果1.不同浓度雄黄对A431细胞增殖的影响当雄黄浓度在30-400μg/ml时,A431细胞的增殖被抑制,其抑制率随雄黄浓度(30,60,100,200及400μg/ml)的增高而增大,抑制率分别为4%,14%,26%,39%及66%。高浓度雄黄处理细胞后产生明显的细胞毒性作用,导致细胞死亡。不同浓度雄黄处理A431细胞24h后,与正常对照组相比,浓度大于60μg/ml时A490差异均具有统计学意义(P<0.05)2.光镜下观察雄黄作用于A431细胞的形态学改变倒置光学显微镜下观察,正常A431细胞呈菱形、多角形,生长旺盛；不同浓度雄黄作用于A431细胞24h后肿瘤细胞生长不佳,细胞体积稍微缩小,形态不规则,胞膜皱缩,部分细胞漂浮,有部分细胞死亡,并出现小片状无细胞生长区,飘浮细胞增多等现象。随着雄黄浓度的增加,上述现象更加明显。而对照组细胞分布均匀,大小基本一致,核固缩现象偶见。3.流式细胞仪检测结果A431细胞经浓度分别为60、100、200μg/ml雄黄作用24 h后,与对照组细胞相比,早期凋亡细胞数分别为15.24%、26.07%和11.97%。4.雄黄对Survivin及Caspase-3 mRNA的影响实验结果表明各浓度组雄黄(60-200μg/ml)作用A431细胞24h后,与对照组比较Caspase-3产物浓度随雄黄浓度升高而增大,但至200μg/ml时,其浓度又明显降低;Survivin产物浓度则随雄黄浓度升高而减小；内参β-actin见不到肉眼可见的浓度变化。结论：(一)Survivin及Caspase-3蛋白在皮肤鳞癌组织中的表达与皮肤鳞癌的发生、发展具有一定的相关性；Survivin蛋白在皮肤鳞癌组织中的表达与鳞癌的组织分化程度有关,分化程度越低其表达率越高,因此Survivin可能抑制了鳞癌组织的凋亡；(二)Survivin与Caspase-3蛋白在皮肤鳞癌组织中的表达呈显著负相关,说明二者之间可能存在负反馈调节作用；(三)在一定浓度范围内,雄黄具有抑制皮肤鳞癌A431细胞株的增殖作用,并呈剂量依赖性；雄黄能诱导皮肤鳞癌A431细胞株的凋亡,并呈剂量依赖性；(四)雄黄对皮肤鳞癌A431细胞株的作用,可能是通过抑制凋亡抑制蛋白Survivin基因的表达、提高凋亡蛋白Caspase-3基因的表达发挥作用的。